Name: 新規ヒアルロン酸ハイドロゲルの三次元卵胞培養への応用とマウス卵巣卵胞凍結保存の方法論 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-09T13:40:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: 学ぶヒアルロン酸ハイドロゲルを用いたマウス卵巣前腔卵胞の三次元培養法とガラス化凍結保存技術。生殖医療への応用可能性を示す革新的な培養システムの確立方法です。

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<ol><li>Telfer, E. E., Andersen, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+growth+and+maturation+of+primordial+follicles+and+immature+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil+Steril%22%5BJournal%5D)">In vitro growth and maturation of primordial follicles and immature oocytes.</a> Fertil Steril. 115 (5), 1116-1125 (2021).</li>
<li>Telfer, E. E., McLaughlin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+history+of+the+mammalian+oocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Biomed+Online%22%5BJournal%5D)">Natural history of the mammalian oocyte.</a> Reprod Biomed Online. 15 (3), 288-295 (2007).</li>
<li>Xiao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+follicle+growth+supports+human+oocyte+meiotic+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">In vitro follicle growth supports human oocyte meiotic maturation.</a> Sci Rep. 5, 17323(2015).</li>
<li>Carabatsos, M. J., Sellitto, C., Goodenough, D. A., Albertini, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocyte-granulosa+cell+heterologous+gap+junctions+are+required+for+the+coordination+of+nuclear+and+cytoplasmic+meiotic+competence%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Oocyte-granulosa cell heterologous gap junctions are required for the coordination of nuclear and cytoplasmic meiotic competence.</a> Dev Biol. 226 (2), 167-179 (2000).</li>
<li>Diaz, F. J., Wigglesworth, K., Eppig, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocytes+are+required+for+the+preantral+granulosa+cell+to+cumulus+cell+transition+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Oocytes are required for the preantral granulosa cell to cumulus cell transition in mice.</a> Dev Biol. 305 (1), 300-311 (2007).</li>
<li>Eppig, J. J., Pendola, F. L., Wigglesworth, K., Pendola, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+oocytes+regulate+metabolic+cooperativity+between+granulosa+cells+and+oocytes%3A+amino+acid+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Mouse oocytes regulate metabolic cooperativity between granulosa cells and oocytes: amino acid transport.</a> Biol Reprod. 73 (2), 351-357 (2005).</li>
<li>Dadashzadeh, A., Moghassemi, S., Shavandi, A., Amorim, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+on+biomaterials+for+ovarian+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">A review on biomaterials for ovarian tissue engineering.</a> Acta Biomater. 135, 48-63 (2021).</li>
<li>Simon, L. E., Kumar, T. R., Duncan, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+ovarian+follicle+growth%3A+a+comprehensive+analysis+of+key+protocol+variablesdagger%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">In vitro ovarian follicle growth: a comprehensive analysis of key protocol variablesdagger.</a> Biol Reprod. 103 (3), 455-470 (2020).</li>
<li>Belli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+3D+culture+of+mouse+ovarian+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Towards a 3D culture of mouse ovarian follicles.</a> Int J Dev Biol. 56 (10-12), 931-937 (2012).</li>
<li>Berkholtz, C. B., Shea, L. D., Woodruff, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+functions+in+follicle+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Reprod+Med%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix functions in follicle maturation.</a> Semin Reprod Med. 24 (4), 262-269 (2006).</li>
<li>Desai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+in+vitro+follicle+growth%3A+overview+of+culture+models%2C+biomaterials%2C+design+parameters+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Biol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional in vitro follicle growth: overview of culture models, biomaterials, design parameters and future directions.</a> Reprod Biol Endocrinol. 8, 119(2010).</li>
<li>Shea, L. D., Woodruff, T. K., Shikanov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineering+the+ovarian+follicle+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Bioengineering the ovarian follicle microenvironment.</a> Annu Rev Biomed Eng. 16, 29-52 (2014).</li>
<li>Paulini, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+and+growth+of+human+preantral+follicles+after+cryopreservation+of+ovarian+tissue%2C+follicle+isolation+and+short-term+xenografting%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Biomed+Online%22%5BJournal%5D)">Survival and growth of human preantral follicles after cryopreservation of ovarian tissue, follicle isolation and short-term xenografting.</a> Reprod Biomed Online. 33 (3), 425-432 (2016).</li>
<li>West, E. R., Xu, M., Woodruff, T. K., Shea, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+properties+of+alginate+hydrogels+and+their+effects+on+in+vitro+follicle+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Physical properties of alginate hydrogels and their effects on in vitro follicle development.</a> Biomaterials. 28 (30), 4439-4448 (2007).</li>
<li>Joo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+collagen+hydrogel+on+3D+culture+of+ovarian+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Mater%22%5BJournal%5D)">The effect of collagen hydrogel on 3D culture of ovarian follicles.</a> Biomed Mater. 11 (6), 065009(2016).</li>
<li>Telfer, E., Torrance, C., Gosden, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+study+of+cultured+preantral+ovarian+follicles+of+mice+after+transplantation+under+the+kidney+capsule%5BTitle%5D)+AND+%22J+Reprod+Fertil%22%5BJournal%5D)">Morphological study of cultured preantral ovarian follicles of mice after transplantation under the kidney capsule.</a> J Reprod Fertil. 89 (2), 565-571 (1990).</li>
<li>Torrance, C., Telfer, E., Gosden, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+study+of+the+development+of+isolated+mouse+pre-antral+follicles+in+collagen+gel+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Reprod+Fertil%22%5BJournal%5D)">Quantitative study of the development of isolated mouse pre-antral follicles in collagen gel culture.</a> J Reprod Fertil. 87 (1), 367-374 (1989).</li>
<li>Dong, C., Yonggang, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+collagen+scaffold+in+tissue+engineering%3A+recent+advances+and+new+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Polymers%22%5BJournal%5D)">Application of collagen scaffold in tissue engineering: recent advances and new perspectives.</a> Polymers. 8 (2), 42(2016).</li>
<li>Le, B. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose-based+3D+culture+improved+the+developmental+competence+of+oocyte-granulosa+complex+isolated+from+porcine+preantral+follicle%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Agarose-based 3D culture improved the developmental competence of oocyte-granulosa complex isolated from porcine preantral follicle.</a> Theriogenology. 223, 11-21 (2024).</li>
<li>Park, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+maturation+on+an+agarose+matrix+improves+the+developmental+competence+of+porcine+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">In vitro maturation on an agarose matrix improves the developmental competence of porcine oocytes.</a> Theriogenology. 157, 7-17 (2020).</li>
<li>Zaniker, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensionally+printed+agarose+Micromold+supports+scaffold-free+mouse+ex+vivo+follicle+growth%2C+ovulation%2C+and+luteinization%5BTitle%5D)+AND+%22Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Three-dimensionally printed agarose Micromold supports scaffold-free mouse ex vivo follicle growth, ovulation, and luteinization.</a> Bioengineering. 11 (7), 719(2024).</li>
<li>Pangas, S. A., Saudye, H., Shea, L. D., Woodruff, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+approach+for+the+three-dimensional+culture+of+granulosa+cell-oocyte+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Novel approach for the three-dimensional culture of granulosa cell-oocyte complexes.</a> Tissue Eng. 9 (5), 1013-1021 (2003).</li>
<li>West, E. R., Shea, L. D., Woodruff, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+the+follicle+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Reprod+Med%22%5BJournal%5D)">Engineering the follicle microenvironment.</a> Semin Reprod Med. 25 (4), 287-299 (2007).</li>
<li>Xu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival%2C+growth%2C+and+maturation+of+secondary+follicles+from+prepubertal%2C+young%2C+and+older+adult+rhesus+monkeys+during+encapsulated+three-dimensional+culture%3A+effects+of+gonadotropins+and+insulin%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Survival, growth, and maturation of secondary follicles from prepubertal, young, and older adult rhesus monkeys during encapsulated three-dimensional culture: effects of gonadotropins and insulin.</a> Reproduction. 140 (5), 685-697 (2010).</li>
<li>Xu, M., Kreeger, P. K., Shea, L. D., Woodruff, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+follicles+produce+live%2C+fertile+offspring%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered follicles produce live, fertile offspring.</a> Tissue Eng. 12 (10), 2739-2746 (2006).</li>
<li>Amorim, C. A., Van Langendonckt, A., David, A., Dolmans, M. M., Donnez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+of+human+pre-antral+follicles+after+cryopreservation+of+ovarian+tissue%2C+follicular+isolation+and+in+vitro+culture+in+a+calcium+alginate+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">Survival of human pre-antral follicles after cryopreservation of ovarian tissue, follicular isolation and in vitro culture in a calcium alginate matrix.</a> Hum Reprod. 24 (1), 92-99 (2009).</li>
<li>Converse, A., Zaniker, E. J., Amargant, F., Duncan, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recapitulating+folliculogenesis+and+oogenesis+outside+the+body%3A+encapsulated+in+vitro+follicle+growth+dagger%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Recapitulating folliculogenesis and oogenesis outside the body: encapsulated in vitro follicle growth dagger.</a> Biol Reprod. 108 (1), 5-22 (2023).</li>
<li>Mainigi, M. A., Ord, T., Schultz, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiotic+and+developmental+competence+in+mice+are+compromised+following+follicle+development+in+vitro+using+an+alginate-based+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Meiotic and developmental competence in mice are compromised following follicle development in vitro using an alginate-based culture system.</a> Biol Reprod. 85 (2), 269-276 (2011).</li>
<li>Kreeger, P. K., Deck, J. W., Woodruff, T. K., Shea, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+in+vitro+regulation+of+ovarian+follicle+development+using+alginate-extracellular+matrix+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The in vitro regulation of ovarian follicle development using alginate-extracellular matrix gels.</a> Biomaterials. 27 (5), 714-723 (2006).</li>
<li>Shikanov, A., Xu, M., Woodruff, T. K., Shea, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interpenetrating+fibrin-alginate+matrices+for+in+vitro+ovarian+follicle+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Interpenetrating fibrin-alginate matrices for in vitro ovarian follicle development.</a> Biomaterials. 30 (29), 5476-5485 (2009).</li>
<li>Griffith, L. G., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+complex+3D+tissue+physiology+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Capturing complex 3D tissue physiology in vitro.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (3), 211-224 (2006).</li>
<li>Irving-Rodgers, H. F., Rodgers, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+of+the+developing+ovarian+follicle%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Reprod+Med%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix of the developing ovarian follicle.</a> Semin Reprod Med. 24 (4), 195-203 (2006).</li>
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<li>Desai, N., Abdelhafez, F., Calabro, A., Falcone, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+dimensional+culture+of+fresh+and+vitrified+mouse+pre-antral+follicles+in+a+hyaluronan-based+hydrogel%3A+a+preliminary+investigation+of+a+novel+biomaterial+for+in+vitro+follicle+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Biol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Three dimensional culture of fresh and vitrified mouse pre-antral follicles in a hyaluronan-based hydrogel: a preliminary investigation of a novel biomaterial for in vitro follicle maturation.</a> Reprod Biol Endocrinol. 10 (1), 29(2012).</li>
<li>Desai, N., Spangler, M., Nanavaty, V., Gishto, A., Brown, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+hyaluronan-based+biomatrix+for+3-D+follicle+culture+yields+functionally+competent+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Biol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">New hyaluronan-based biomatrix for 3-D follicle culture yields functionally competent oocytes.</a> Reprod Biol Endocrinol. 20 (1), 148(2022).</li>
<li>Monti, M., Redi, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+mouse+antral+oocytes+based+on+nucleolar+chromatin+organization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of mouse antral oocytes based on nucleolar chromatin organization.</a> J Vis Exp. (107), e53616(2016).</li>
<li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+human+ovarian+tissue+by+solid-surface+vitrification%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Obstet+Gynecol+Reprod+Biol%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of human ovarian tissue by solid-surface vitrification.</a> Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 139 (2), 193-198 (2008).</li>
<li>Chan, J., Darr, A., Alam, D., Calabro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+a+novel+cross-linked+hyaluronan+hydrogel+for+use+as+a+soft-tissue+filler%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Cosmetic+Sur%22%5BJournal%5D)">Investigation of a novel cross-linked hyaluronan hydrogel for use as a soft-tissue filler.</a> Am J Cosmetic Sur. 22, 105-108 (2005).</li>
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<li>Xu, M., West, E., Shea, L. D., Woodruff, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+stage-specific+permissive+in+vitro+culture+environment+for+follicle+growth+and+oocyte+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Identification of a stage-specific permissive in vitro culture environment for follicle growth and oocyte development.</a> Biol Reprod. 75 (6), 916-923 (2006).</li>
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<li>Wu, J., Nayudu, P. L., Kiesel, P. S., Michelmann, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luteinizing+hormone+has+a+stage-limited+effect+on+preantral+follicle+development+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Luteinizing hormone has a stage-limited effect on preantral follicle development in vitro.</a> Biol Reprod. 63 (1), 320-327 (2000).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>抗アルファチューブリン-FITC標識</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>F2168</td><td></td></tr><tr><td>抗ベータチューブリン-FITC標識</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>F2043</td><td></td></tr><tr><td>BZ-X700</td><td>キーエンス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>センターウェル皿</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>08-772-12</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼI型</td><td>ワージントンバイオケミカルコーポレーション</td><td>LS004196</td><td></td></tr><tr><td>クライキャップバイアル通気式</td><td>ハンプトン・リサーチ</td><td>HR4-904</td><td></td></tr><tr><td>クライオループ</td><td>ハンプトン・リサーチ</td><td>HR4-974</td><td></td></tr><tr><td>クリスタルキャップ</td><td>ハンプトン・リサーチ</td><td>HR4-733</td><td></td></tr><tr><td>培養皿 60mm</td><td>フィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td>08-772B</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド(DMSO)</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>D2650型</td><td></td></tr><tr><td>上皮成長因子(EGF)</td><td>R&(R&)Dシステム</td><td>236-EG</td><td></td></tr><tr><td>エチレングリコール(EG)</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>293237</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清-熱不活化</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>卵胞刺激ホルモン (FSH)</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>F4021</td><td></td></tr><tr><td>グローバル-ヘペス&nbsp;中程度</td><td>クーパーサージカル</td><td>LGGH-100型</td><td></td></tr><tr><td>ヘクスト 33342</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>B2261</td><td></td></tr><tr><td>ヒト絨毛性ゴナドトロピン (hCG)</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>CG10</td><td></td></tr><tr><td>ヒト血清アルブミン</td><td>クーパーサージカル</td><td>GHSA-125</td><td></td></tr><tr><td>ヒアルロニダーゼ</td><td>クーパーサージカル</td><td>ART-4007-A</td><td></td></tr><tr><td>過酸化水素</td><td>CVS薬局株式会社</td><td>372441</td><td></td></tr><tr><td>インスリン-トランスフェリン-セレン(ITS)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>41400-045</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz培地(L-15)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>11415-064</td><td></td></tr><tr><td>黄体形成ホルモン</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>L9773</td><td></td></tr><tr><td>磁気ワンド</td><td>ハンプトン・リサーチ</td><td>HR4-729</td><td></td></tr><tr><td>マイクロピペット (1000 & micro;m)</td><td>ミニチューブ</td><td>19025/0050</td><td></td></tr><tr><td>マイクロピペット (175、200、および 275&micro;m)</td><td>クーパーサージカル</td><td>MXL3-175、MXL3-200、MXL3-275</td><td></td></tr><tr><td>Millex GVフィルター0.22&マイクロ;m</td><td>ミリポール</td><td>SLGU033RS</td><td></td></tr><tr><td>鉱油</td><td>クーパーサージカル</td><td>LGOL-500</td><td></td></tr><tr><td>最小エッセンシャルミディアムアルファ(MEM)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>32561-037</td><td></td></tr><tr><td>卵母細胞イメージングシステム-Spindleview</td><td>ハミルトン・ソーン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水(PBS)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>ヨウ化プロピジウム</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>P4170</td><td></td></tr><tr><td>ラピッドi</td><td>ビトロライフ</td><td>14406</td><td></td></tr><tr><td>スマートボックス</td><td>ビトロライフ</td><td>14423</td><td></td></tr><tr><td>合成タンパク質代替物(SPS)</td><td>クーパーサージカル</td><td>アート-3011</td><td></td></tr><tr><td>チラミン結合ヒアルロン酸バイオヒドロゲルキット&nbsp;</td><td>ライフコア</td><td>英語-00151</td><td></td></tr><tr><td>超音波シーラー</td><td>ビトロライフ</td><td>14415</td><td></td></tr><tr><td>ユニバーサルGPSカルチャーディッシュ8x 100&micro;l ウェルズ</td><td>クーパーサージカル</td><td>UGPS-010</td><td></td></tr></tbody></table>

新規ヒアルロン酸ハイドロゲルの三次元卵胞培養への応用とマウス卵巣卵胞凍結保存の方法論

Application of a Novel Hyaluronan Hydrogel for Three-Dimensional Follicle Culture and Methodology for Mouse Ovarian Follicle Cryopreservation

この論文では、新規のチラミン結合ヒアルロン酸ゲルをマウス前胞胞のin vitro培養に用いる方法論を詳述している36,37。図 6 は、従来の 2 次元培養システムに置いた場合と、HA ゲルにカプセル化して 3 次元培養を行った場合の 1 つの卵胞との違いを示しています。在来の卵胞の建築は、12日間の培養期間中維持され、成長の最終日には前庭部がはっきりと見えます。
HAゲルは非常に汎用性が高く、孤立した卵胞を単独またはグループで成長させることができ、また卵巣組織は機械的に小さな卵胞の塊に分解されます。ゲルは透明であるため、深さが異なっていても卵胞を視覚化することができます。カプセル化された卵胞とFL-Cは、継続的な顆粒膜細胞の増殖から半径方向の増殖を示します(図7)。初期の卵胞の直径は平均139.8±28μmで、GV卵子の直径は63.5±4.6μmです。単体培養卵胞では、最終直径は約385.6±36.7μmで、サイズは約3倍に増加します。排卵した中期II卵子は、約84.8±3.8μmを測定します。培養FLクラスター内では、卵胞のサイズはかなり多様です(図5、 図7)。hCGトリガー後の排卵細胞は、卵胞の近くに見られます(図8)。中期 II 卵子の大部分は、排卵した COC から回収されます。トリガー後も埋め込まれた卵胞には、通常、GVおよび中期I卵子が含まれています。
表1 は、単離された卵胞と新鮮または凍結卵巣のFLクラスターとの間の成熟速度を対比しています。凍結保存された卵巣由来のFL-Cは、成熟率が有意に低かった。顕微鏡観察では、基底板が頻繁に壊れていることが示され、卵母細胞の早期押し出しに非常に敏感でした。卵胞クラスターの壊れやすい性質は、カプセル化によっていくらか打ち消されました。凍結保存された卵巣のコラゲナーゼ処理は、生存率が低く、無傷の卵胞の収量が少ないため、特に損傷を与えるため、避けられました。
単離された卵胞の凍結保存は、卵巣全体の保存よりもはるかに効果的です。高い成熟速度は、検討した両方のガラス化方法で達成できます(表2)。冷却速度には大きな差があるにもかかわらず、IVC後の卵子の成熟には差はありませんでした。CLオープンキャリアは、1つのCLオープンキャリアに最大10個の卵胞を装填できるため、効率が向上します。これにより、複数の凍結保存された卵胞を回収するための全体的な時間も短縮されます。しかし、ヒト卵胞に対するガラス化の最終的な臨床応用には、クローズドシールシステムが好ましい場合があります。
GV卵子の核小体周りのクロマチン配列は、排卵後に受精し、胚盤胞に発達する可能性が最も高い卵子を特定するために使用できる38。 図9 は、クロマチン分布パターンを視覚化するための卵子の生染色を示しています。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67786/67786fig01.jpg"> 図1:卵胞の成長の概略図。 この図は、一次卵胞から二次前胞期、そして最終的には排卵の準備が整った完全に成熟した三次卵胞までの卵胞発達のさまざまな段階を示しています。典型的な前胞状卵胞の顕微鏡画像も、その異なる形態学的特徴とともに示されています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67786/67786fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67786/67786fig02.jpg"> 図2:HAカプセル化方式の概略図。この図には、ヒアルロン酸ゲルの構造と卵胞包埋のさまざまなステップが示されています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67786/67786fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67786/67786fig03.jpg"> 図3:卵胞の単離とカプセル化 (A、B)倍率40倍および200倍で埋埋込するために選択された前傘下卵胞 (C)アポトーシス卵胞は、卵母細胞が中心ではない健康な前胞状卵胞で示されています。(D)卵胞を播種したHAゲルビーズのイメージと、(E)FL-Cを2個播種したイメージ。実体顕微鏡で撮影した画像で、ゲルビーズ全体を示しています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67786/67786fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67786/67786fig04.jpg"> 図4:単離された卵胞の凍結保存のためのガラス化装置。 CLオープンキャリアデバイスでは、卵胞を液体窒素に直接浸すことによりガラス化ステップが行われます。したがって、冷却速度は-20,000°C/minを超える非常に高速です。対照的に、RIクローズドキャリアでは、卵胞は内側のプラスチックスティックにロードされ、液体窒素に浸された外側のストローに落とされます。この閉鎖的なガラス化方法は、液体窒素との直接接触を避けます。ただし、冷却速度は-1220°C/minで大幅に低下します。どちらのキャリアからでも卵胞のローディングと回収は簡単です。CLオープンキャリアは、RIクローズドキャリアではわずか2個であったのに対し、デバイスあたり最大10個の卵胞のローディングに対応しました。この数値は35から修正されています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67786/67786fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67786/67786fig05.jpg"> 図5:発生した問題の代表的な画像 (A)卵子が押し出された卵胞クラスター。(B)基底層膜が壊れた単離された卵胞と、卵母細胞が押し出された卵胞。(C)ゲル内の気泡の下に包埋された卵胞。(D)ゲル状に残った卵胞クラスター(左)と、深すぎて最終的に皿に付着したクラスターと比較。FL-Cの幅広い卵胞サイズがはっきりと見えます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67786/67786fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67786/67786fig06.jpg"> 図6:従来の2D培養とHAの3D培養における卵胞成長の比較。 2次元成長では、卵胞の平坦化と組織培養皿への顆粒膜細胞の付着が4日目までに観察され、卵子は顆粒膜細胞の遊走、ギャップ結合の破壊、および早期卵子の押し出しに対して脆弱になりました。HAカプセル化された卵胞は、培養間隔全体を通して付着しないままでした。顆粒膜細胞の増殖は全方向に起こり、卵子を包み込み、3D構造を維持しました。この数値は36から変更されています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67786/67786fig06large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67786/67786fig07.jpg"> 図7:チラミン結合HAゲルに包まれた卵胞の代表的な画像 (A)1日目に新鮮な卵巣のコラゲナーゼ消化後に採取した胞体前卵胞。(B)1日目および(C)培養4日目に画像化された4つの前胞卵胞を播種したゲルドロップ(D)2日目に新鮮な卵巣からの卵胞クラスター、(E)6日目および(F)培養9日目。(G)培養の2日目と(H)6日目に示されているガラス化全卵巣から機械的に解剖された卵胞クラスター。(I)前庭部形成を伴う卵胞は、培養の9日目にはっきりと見えます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67786/67786fig07large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67786/67786fig08.jpg"> 図8:卵子の排卵 (A, B) 排卵卵丘-卵母細胞複合体(COC)を次に示すHA-gelビーズ。(C)COCをヒアルロニダーゼで酵素処理した後、卵母細胞をイメージングし、周囲の卵丘細胞を除去した。多数の中期II卵子。(D)顕著な極性体を持つ中期II卵子。倍率400倍 (E) 偏光を用いた中期II卵子のライブイメージングと、減数分裂紡錘体を可視化し組織を評価するイメージングシステム、37に記載されているように行われる。倍率400倍。通常の複屈折スピンドルが見えます。(F)中期II卵子を固定し、抗α/β-チューブリンとヨウ化プロピジウムで染色して、減数分裂紡錘体組織を視覚化します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67786/67786fig08large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67786/67786fig09.jpg"> 図9:GV卵子におけるクロマチン再編成。 前庭部形成後のGV卵子のクロマチン配列を、Hoechst 33342(50 ng/mL)によるDNA染色により検討した。代表的な卵胞は、穏やかなピペッティングによりHAビーズから採取しました。顆粒膜細胞はヒアルロニダーゼを用いて除去した。その後、GV卵子を15分間染色した(Monti et al.38によるプロトコールを参照)。画像は40倍の倍率で撮影されました。(A)培養開始時の1日目に示されたGV卵子で、非囲型クロマチン(NSN)染色パターンが認められた。(B)hCGトリガーの日に示された前庭部の成長卵胞からのGV卵子。クロマチンは凝縮し、核小体の周りに核周囲環を形成しました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67786/67786fig09large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>パラメーター</td>
			<td colspan="2">新鮮な卵巣</td>
			<td>凍結卵巣</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>FL絶縁</td>
			<td>FLクラスタ</td>
			<td>FLクラスタ</td>
		</tr><tr><td>IVC中に観察された卵胞</td>
			<td>130</td>
			<td>154</td>
			<td>69</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">HCG後の排卵(%)</td>
			<td>71%</td>
			<td>66%</td>
			<td>93%</td>
		</tr><tr><td>(92/130)</td>
			<td>(101/154)</td>
			<td>(64/69)</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">GVBD(%)</td>
			<td>30%</td>
			<td>28%</td>
			<td>52%</td>
		</tr><tr><td>(28/92)</td>
			<td>(28/101)</td>
			<td>(33/64)</td>
		</tr><tr><td>MII卵子形成(%)</td>
			<td>59%</td>
			<td>55%</td>
			<td>*34%</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>(54//92)</td>
			<td>(56/101)</td>
			<td>(22/64)</td>
		</tr></tbody></table>表1:新鮮卵巣およびガラス化卵巣からのHA包埋卵子による転帰。 新鮮卵巣由来の卵胞とFL-Cは、HAゲルにカプセル化した後、 in vitro で成熟させました。HAゲルは、EG/DMSOプロトコル39を用いてガラス化した卵巣の卵胞でも試験した。新鮮な卵巣では、コラゲナーゼ消化後に個々の卵胞(FL)と卵胞クラスター(FL-C)の両方を採取しました。ガラス化した卵巣の場合、コラゲナーゼへの曝露は、実際には卵胞に損傷を与えていました。凍結保存された卵巣の最善のアプローチは、個々の卵胞ではなくFLクラスターを分離し、針による機械的解剖のみを行うことであった。この表は、4〜6個の卵胞を播種したHAビーズと、6〜10個の卵胞を含む単一のFL-Cビーズの結果を対比したものです。*凍結保存された卵巣からのFL-Cによる成熟率は有意に低かった(p = 0.008;有意性を検定するためのカイ 2 乗分析)。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2">キャリア</td>
			<td>RIの</td>
			<td>CLの</td>
		</tr><tr><td>(終了しました)</td>
			<td>(オープン)</td>
		</tr><tr><td>生存率(%)</td>
			<td>100% (24/24)</td>
			<td>100% (41/41)</td>
		</tr><tr><td>アントラム形成* (%)</td>
			<td>25.0% (6/24)</td>
			<td>75.6% (31/41)*</td>
		</tr><tr><td>排卵率(%)</td>
			<td>66.7% (16/24)</td>
			<td>87.8% (36/41)</td>
		</tr><tr><td>成熟率(% MIIs)</td>
			<td>81.3% (13/16)</td>
			<td>69.4% (25/36)</td>
		</tr></tbody></table>表2:2つの異なるガラス固化装置で単離された卵胞を凍結保存した後の結果。 オープンCLデバイスとクローズドRIキャリアの両方で高い成熟速度が達成され、冷却速度は低くなっています。前庭部形成は、有意であると観察された唯一のアウトカム指標であったが、全体的な成熟率に影響を与えなかった(p &lt; 0.05;有意性を検定するためのカイ 2 乗分析)。

The 3-D architecture of the ovarian follicle and the complex interactions between somatic cell components and the oocyte that are necessary for ...

application-novel-hyaluronan-hydrogel-for-three-dimensional-follicle

Research

JoVE Journal

Biology

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