新規ヒアルロン酸ハイドロゲルの三次元卵胞培養への応用とマウス卵巣卵胞凍結保存の方法論

この研究は、in vitro 卵胞の成長と卵母細胞の成熟のための 3D 培養システムの開発に焦点を当ててきました。細胞の天然細胞外マトリックスの成分を使用してこのようなシステムを作成すると、卵胞の発達が促進されます。最大の課題は、動物モデルからの知識をヒトの卵胞培養に適用することです。

ヒトの卵巣組織へのアクセスは制限されています。また、ヒトの卵胞は、卵母細胞の成熟を達成するために培養中でかなり長い時間を必要とします。この研究で開発された3D培養モデルは、ヒト卵胞の培養に特に有用であり、卵母細胞の成熟に必要な培養に必要な長時間にわたって3D構造を保持することができます。

まず、手順のために生後10〜14日齢のB6D2F1マウスの子犬から卵巣を入手します。6 ミリリットルの事前平衡化卵胞培地(FCM)を2つの60ミリメートルの皿にピペットで入れ、鉱物油でオーバーレイしてインキュベートします。1ミリリットルのコラゲナーゼを皿の中央ウェルにピペットでかけ、3ミリリットルの卵巣組織またはOT培地を外側のウェルにピペットで入れます。

卵巣をコラゲナーゼ溶液に移動します。コラゲナーゼインキュベーションの最後に、コラゲナーゼ処理された卵巣を外側のウェルに移動してすすぎます。マイクロピペットを交換し、卵巣をOT培地で満たされた新鮮な皿に移します。

卵胞を採取するには、さまざまなサイズにカットされたピペットチップを介して、酵素処理された卵巣組織を繰り返し吸引して排出します。27ゲージの針を使用して組織を機械的にからかい、卵胞を8回放出します。40倍の倍率で解剖顕微鏡で検査し、無傷の基底膜内に囲まれた中央に位置する卵母細胞を持つ二次前胞胞を新鮮なOT皿に選びます。

包埋プロセスを開始する前に、FCM2皿をインキュベーターに60分間入れます。過酸化水素を含まない25マイクロリットルのHAゲルを蓋に2滴垂らしてすすぎます。埋め込む卵胞または卵胞クラスターをFCM皿からヒアルロン酸またはHAゲルの一滴に移動し、培地を洗い流します。

FCM皿をバブラーの下に戻してガスを出します。卵胞を埋め込むには、1マイクロリットルの0.03%過酸化水素滴を60ミリメートルの皿の蓋の上に置きます。次に、25マイクロリットルの3ミリグラムのHAゲルを加えて混合します。

約8〜10マイクロリットルのHA過酸化水素混合物を8ウェル培養皿の2つの別々のウェルにピペットで入れます。そして、卵胞、卵胞クラスター、または卵巣組織の断片を各滴の中心にすばやく移します。ドロップ内に気泡がないことを確認してください。

3分後、100マイクロリットルの事前平衡化卵胞培地を各ウェルに加えます。温かいプレ平衡化鉱物油を重ね、皿をインキュベートします。ガラス化プロセスに必要な装置と溶液を準備します。

RIキャリアを液体窒素の入ったクライオボックスのスロットに配置します。予熱したガラス化溶液1、またはVS1を2滴並べて、上部近くの60ミリメートルの皿の蓋の上に置きます。次に、2つの卵胞を最初の滴に入れ、すすぎ、VS1の2番目の滴にすばやく移動して5分間のインキュベーションを行います。

卵胞がインキュベートしている間に、VS1滴のすぐ下にVS2滴を3滴作ります。次に、60秒以内に3回のVS2滴を通して卵胞を順番に素早く動かします。ガラス化のために、VS2から卵胞を拾います。

RIキャリアを解剖範囲で表示します。そして、プラスチックスティックの小さな穴を視覚化するように焦点を調整します。最小限の液体で卵胞を穴に沈着させます。

プラスチックスティックを予冷した外側のストローに落とします。そして超音波シーラーを使ってストローを閉じます。ストローをクライオケーンに取り付けたゴブレットに入れます。

杖をプラスチック製の保護スリーブで覆い、液体窒素に浸します。オープンキャリアのガラス化の場合は、金属製のCLステムを磁化されたバイアルキャップに挿入してキャリアを準備し、しっかりと保持します。クライオ バイアルを保持するためのラックをクライオ ボックスに置き、液体窒素がバイアルの上部より下にあることを確認します。

磁化された発明されたクライオバイアルに液体窒素を充填し、ラックに入れます。磁気ワンドを使用して、付属の磁気キャップでCLオープンキャリアをつかみます。CLキャリアをVS2の別の滴に浸して、凍結保護膜を作成します。

すべての卵胞または卵胞クラスターを拾い上げ、最小限の液体でフィルムの上に置きます。液体窒素で満たされたクライオバイアルにすぐにCLを浸漬し、サンプルを活性化します。クライオバイアルをクライオケーンの上に置き、プラスチックスリーブで覆います。

サトウキビを液体窒素貯蔵タンクに突っ込みます。外側のウェルに3ミリリットルの事前平衡化FCM、センターウェルに1ミリリットルのセンターウェルディッシュを準備します。培地に油を塗った後、皿をバブラーの下に置き、ガスを吹き込みます。

摂氏37度に予備平衡化された0.5ミリリットルの加温溶液WS1およびWS2を、ラベルの付いた2つのセンターウェル皿に入れます。サンプルの入ったクライオケーンを貯蔵タンクから液体窒素で満たされたクライオボックスに移動します。まず、プラスチック製の杖カバーを取り外します。

次に、ストローを浸したまま、ゴブレットから取り出し、クライオボックスの保持スロットにスライドさせます。黒い点のすぐ上の外側のストローを切ります。内側のプラスチックスティックを外側のストローから持ち上げ、スティックをWS1にすばやく浸し、10秒以内に卵胞を降ろすためにゆっくりと回転させます。

WS1で2分間後、マイクロピペットを使用して卵胞または卵胞クラスターをWS2に移し、3分間のインキュベーションを行います。次に、それらをFCM皿に移し、包埋する前に中央で卵胞を1〜2時間インキュベートします。オープンキャリアCL加温の場合は、FCMおよびWS皿の調製を繰り返します。クライオケーンをクライオボックスに移し、プラスチック製のケーンカバーを取り外します。

磁気ワンドを使用して、CLの金属ステムが見えるまでクライオバイアルキャップを持ち上げます。付属のCLキャリアでキャップを磁気ワンドでつかみます。そして、CLをWS1に素早く浸し、旋回させて10秒以内に卵胞を降ろします。

前庭胞の成長は、3次元ヒアルロン酸ゲル培養で維持され、12日目までに前庭部が見える天然の卵胞構造が維持されました。ヒアルロン酸ゲルにカプセル化された卵胞は、肉芽症細胞の増殖による放射状の拡大を示し、培養期間にわたって卵胞の直径が約 139.8 マイクロメートルから 385.6 マイクロメートルに増加しました。排卵中期の2つの卵母細胞は、ヒト絨毛性ゴナドトロピン誘発後の卵胞の近くで発見されました。

卵母細胞の直径は約84.8マイクロメートルでした。新鮮な卵巣では、個々の卵胞と卵胞クラスターの両方が良好な成熟率を示しました。凍結保存された卵巣からの卵胞クラスターは、早期卵母細胞の押し出しにつながる低い成熟率を示しました。

単離された卵胞凍結保存は、卵巣全体の保存よりも効果的でした。両方のキャリアでの卵胞ガラス化は、冷却速度の違いに関係なく、高い成熟率を達成しました。CLオープンキャリアシステムにより、複数の卵胞を効率的に凍結保存することができ、処理時間が短縮されました。