脳蛍光染色および免疫染色を強化するための ショウジョウバエ 頭部の直接凍結切片

私たちのチームは、ショウジョウバエモデルを使用して、代謝障害、心臓障害、筋肉睡眠、老化障害を研究しています。このJoveの論文では、斬首、固定、凍結切片、染色、イメージングなど、脳組織処理の簡略化されたプロトコルについて詳しく説明しています。私の研究グループは、いくつかのヒトの病気と老化を研究するために、ショウジョウバエモデルの開発を先駆的に行ってきました。

また、時間制限のある食事や運動などの介入についても調査しました。機械学習、オミクス、分子的アプローチを用いて、概日リズムや遺伝学などの因子を研究し、それらが細胞の完全性、生理機能、行動に及ぼす影響を明らかにします。この簡素化されたショウジョウバエの脳研究プロトコルは、複雑な解剖を回避し、片手での実行のみを必要とし、高価な共焦点顕微鏡検査の必要性を排除し、アクセシビリティを高め、機器への依存を減らします。

まず、老朽化したバイアルでハエを入手し、二酸化炭素マットのバルブを開き、ハエをマットにすばやく捨てて逃げないようにします。ハエがほとんど意識を失ったら、マットを対物レンズの下に移動させて、ハエをSZ61顕微鏡の下に配置します。ハエがはっきりと見え、首を切るのに快適になるまで、倍率と焦点を調整します。

スプリングハサミを使用して、ハエの胸部と頭の間にブレードを配置し、しっかりと絞って、実験グループごとに5〜10匹のハエの頭を斬首します。使用済みのハエを老朽化したバイアルに戻します。ブラシを使用して、斬首されたハエの頭を氷の上に置かれたラベル付きの1.5ミリリットルのチューブにそっと移します。

チューブを氷から取り出した後、100マイクロリットルの4%パラホルムアルデヒドとPBSを各チューブにピペットで入れ、すべてのフライヘッドが完全に水没するようにします。ヘッドがチューブ壁に付着している場合は、ブラシを使用してヘッドをそっと下に押し下げるか、チューブを水平面に軽くたたいて、溶液と適切に接触するようにします。次に、チューブをオービタルシェーカーで中程度に設定した状態で15分間インキュベートします。

パラホルムアルデヒド溶液を廃棄し、PBSと交換して、すべてのフライヘッドが水没していることを確認します。最終洗浄後、フライヘッドをPBSの10%ショ糖溶液に移し、チューブ内に沈められていることを確認します。ラベル付き金型を最適な切削温度またはOCTコンパウンドで約50%の容量まで充填し、金型の四隅すべてに広がるようにします。

ブラシを使用して、収集した固定フライヘッドを金型内のOCTコンパウンドの表面に慎重に置きます。鉗子の先端を使用して、各ヘッドを型底にそっと押し込み、目が下を向いて冠状面を切るようにします。すべてのヘッドをX、Y、Z寸法に慎重に位置合わせして、すべてのセクションにすべての実験グループが同時に含まれるようにします。

ヘッドを適切に位置合わせした後、マイナス20°Cに設定した冷凍庫に直接型を慎重に入れて凍結します。金型がほぼ固まったら、残りのスペースをOCTコンパウンドで満たします。金型凍結切片の場合は、金型の上部にOCT化合物をたっぷりと塗布して、チャックビットを金型に取り付けます。

ビットを上に平らに置き、クライオスタット内で完全に凍結させます(通常5分かかります)。次に、ビットとOCTブロックを金型から外します。ブロックをチャックに配置し、適切な上から下の向きが維持されていることを確認し、ブロックがしっかりと固定されるまでチャックキーを締めます。

調整ノブとチャック深さコントロールを使用して、ブロックをブレードに合わせます。クライオスタットのセクション幅を20マイクロメートルに設定し、アンチロールガラスが各スライスを捕捉できるようにしながら、ゆっくりとした一貫した動きで各スライスを切断します。次に、ウォームスライドを使用して、スライドをセクションに近い端に触れ、セクションがスライド上に浮き上がるようにして、セクションをキャプチャします。

スライドを室温で30分以上、1時間以内で乾燥させます。凍結切片のショウジョウバエのフライヘッドを取り、かみそりの刃を使用してスライドの端に残っているOCT化合物を取り除き、疎水性の境界のためのスペースを残します。次に、疎水性マーカーを使用して各スライドの周りに境界線を描き、5分間乾燥させます。

スライドを優しくピペッティングして、すべてのスライドをPBSを使用してそれぞれ5分間3回洗浄します。スライドを洗浄した後、Tris Buffered Salineブロッキング溶液で3%BSAをスライドにピペットで移し、30分から1時間インキュベートします。次に、ブロッキング溶液を廃棄し、一次抗体溶液をスライド上にピペットで移します。

乾燥を防ぐために、抗体を摂氏4度で一晩、またはウェットティッシュワイプを使用して室温で1時間インキュベートします。一次抗体溶液を廃棄し、PBSを使用してスライドを3回、5分間ずつ洗浄します。次に、二次抗体溶液をスライドに加え、室温で1時間インキュベートします。

スライドをPBSで3回洗浄した後、スライドに少量のPBSだけを残します。次に、1000マイクロリットルのピペットを使用して、DAPIを含む硬化封入剤をスライド全体に均等に3〜5滴加えます。スライドにカバースリップを置き、配置中に気泡が形成されないようにします。

マウントしたばかりのスライドは慎重に取り扱い、封入剤が完全に乾くまで平らに保管してください。長期保存が必要な場合は、スライドの端をシールしてください。蛍光の減衰を最小限に抑えるために、できるだけ早くスライドの画像をキャプチャします。

画像取得中は、すべての実験グループ間で一貫性を保つために、同じチャネル内の各ユニークな被写体に焦点を当てます。選択したすべてのチャンネルで露出オーバーを避けるために、各チャンネルの露出を調整します。選択した曝露が一定であり、特に異なる実験グループ間で、すべての被験者に適切であることを確認してください。

ApoE抗体タグの発現は、Elav+およびElav-ApoE4検体の脳領域に明確に局在していました。脂質の蓄積は、ナイルレッド染色によって示され、これは両方の遺伝子型の脳領域で見られました。