Name: 生体分子の局所柔軟性を特徴付けるための単一分子からの時間分解蛍光異方性 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-04-25T13:40:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: 学ぶ単一分子時間分解蛍光異方性法による生体分子の局所柔軟性と動態解析。FoxP1タンパク質の無秩序構造と二量体化による折りたたみ変化を観測し、タンパク質動態の理解を深める手法を解説。

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<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 488</td><td>ThermoFisher Scienctific</td><td>A20100</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A20100?SID=srch-srp-A20100</td></tr><tr><td>Amicon 超遠心フィルター、10 kDa MWCO</td><td>ミリポア シグマ</td><td>UFC901008</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/mm/ufc9010</td></tr><tr><td>アンピシリン ナトリウム塩</td><td>ミリポア シグマ</td><td>A0166-5G</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/a0166</td></tr><tr><td>BODIP FL マレイミド (BODIPY FL N-(2-アミノエチル))マレイミド)</td><td>ThermoFisher Scienctific</td><td>B10250</td><td></td></tr><tr><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/B10250?SID=srch-srp-B10250 使い捨て PD 10 脱塩カラムミ</td><td>リポア シグマ</td><td>GE17-0851-01</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/ge17085101</td></tr><tr><td>ジチオスレイトール</td><td>ミリポア シグマ</td><td>10197777001</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/roche/dttro</td></tr><tr><td>DMSO、無水</td><td>サーモフィッシャー Scienctific</td><td>D12345</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/D12345?SID=srch-srp-D12345</td></tr><tr><td>DNAse</td><td>ミリポア シグマ</td><td>10104159001</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/roche/10104159001</td></tr><tr><td>大腸菌 C41細菌細胞&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Foresigh Nuvi Ni-Charged IMAC、5 mL カラム</td><td>Bio-Rad</td><td>12004037</td><td></td></tr><tr><td>https://www.bio-rad.com/en-us/sku/12004037-foresight-nuvia-ni-charged-imac-5-ml-column?ID=12004037 HEPES</td><td>Millipore Sigma</td><td>7365-45-9</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/h3375</td></tr><tr><td>イミダゾール</td><td>Millipore Sigma</td><td>288-32-4</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/i5513</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>ミリポア シグマ</td><td>I6758-1G</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sial/i6758</td></tr><tr><td>MCE メンブレン フィルター、0.22 &m 細孔サイズ</td><td>ミリポア シグマ</td><td>GSWP02500</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/mm/gswp02500</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>ミリポア シグマ</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/s3014 Nunc Lab-Tek II チャンバー スライド システム</td><td>ThermoFisher Scienctific</td><td>154534</td><td></td></tr><tr><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/154534 OverExpress C41(DE3) 化学的にコンピテントセル</td><td>ミリポアシグマ</td><td>CMC0017-20X40UL</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/cmc0017</td></tr><tr><td>PMSF</td><td>ミリポアシグマ</td><td>329-98-6</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/78830</td></tr> ロー<tr><td>ダミン 110</td><td>サーモフィッシャー</td>科学<td>419075000</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/419075000?SID=srch-hj-419075000</td></tr><tr><td>ナトリウムリン酸二塩基</td>性ミ<td>リポア シグマ</td><td>7558-79-4</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/s3264</td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム一塩基性二水和物</td><td>ミリポア シグマ</td><td>13472-35-0</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/71505</td></tr><tr><td>TCEP、塩酸塩、試薬グレード</td><td>ミリポア シグマ</td><td>580567-5GM</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/mm/580567</td></tr><tr><td>トゥイーン 20</td><td>ミリポア シグマ</td><td>11332465001</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/roche/11332465001</td></tr></tbody></table>

生体分子の局所柔軟性を特徴付けるための単一分子からの時間分解蛍光異方性

Time-Resolved Fluorescence Anisotropy from Single Molecules for Characterizing Local Flexibility in Biomolecules

蛍光異方性は、蛍光色素の吸収と発光双極子モーメントの相対的な配向から生じます。蛍光色素が偏光にさらされると、入射光の電場ベクトルに整列した吸収遷移モーメントを持つ蛍光色素が優先的に励起されます(光選択)。その結果、励起状態の集団は部分的に配向するようになり、励起された分子のかなりの割合が、偏光励起光61の電場ベクトルと整列した遷移モーメントを有する。蛍光色素は、ブラウン運動により回転します。したがって、発光遷移モーメントも回転し、蛍光異方性に時間依存性になります。この効果は、蛍光分子の回転運動の測定、結合イベントの検出、蛍光色素の環境の特性評価、分子動力学の捕捉に使用できます。
単一分子実験は、サンプルの不均一性を決定するための独自の態勢を整えています。単一分子の感度と蛍光異方性を利用することで、マルチパラメータ蛍光分光法に別の次元が追加されます。一般的な単一分子共焦点顕微鏡(図2)20,21では、蛍光異方性は、パルスレーザーを使用する場合、強度ベースまたは時間分解によって決定できます。
共焦点顕微鏡62における高開口対物レンズの脱分極効果を考慮するために、時間分解異方性35,63の適切な形態は、次式で与えられる。
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq01.jpg" style="margin: auto;">(1)
ここで、<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq02.jpg" style="margin: auto;">および<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq03.jpg" style="margin: auto;">は、波長Xでの励起後のy番目の検出チャネルにおける時間分解蛍光強度であり、平行および垂直偏光L1およびL2についてであり、これらの測定で使用される高い開口数(NA)対物レンズによる平行信号と垂直信号との間の混合を説明する因子である35,62、64.色素の平行、<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq04.jpg" style="margin: auto;">、および垂直の検出チャネル(<img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq05.jpg" style="margin: auto;">)の検出効率の違いは、検出効率の比率<img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq06.jpg" style="margin: auto;">で補正されます。GUV は G ファクターとも呼ばれます。
時間分解蛍光異方性は、多指数関数的崩壊を使用してモデル化でき、蛍光色素がより大きな生体分子に結合していることを説明できます。
<img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq07.jpg" style="margin: auto;">,     (2)
ここで、r0 は蛍光色素依存の基本異方性 (通常は r0 = 0.38)、 r∞ は残留異方性、ρ1 と ρ2 はそれぞれ速い回転相関時間 (蛍光色素分子の局所的な運動) と遅い (高分子の全体的な運動) 回転相関時間です。
単一分子異方性測定(図2)では、バースト積分蛍光寿命(BIFL)分析33,35を使用して個々のエミッターを識別するために、光子到着時間が記録される。光子間の到着時間(Δt)は、移動平均を使用して平滑化され、視覚化を支援するためにプロットされます。これらの時間のヒストグラムには、背景から発生する光子の平均と標準偏差を決定するために、半ガウス分布が適合されます。標準偏差の倍数に設定された任意のしきい値を使用して、各バーストの最初と最後の光子を識別しながら、個々のイベントを除外します。次いで、各バースト内の光子は、式1および2を使用して、または最尤推定器35を介して、時間分解および強度ベースの定常状態蛍光異方性を計算することを含む、さらなる分析のために統合される。単一分子イベントにおける光子の数が限られているため、最尤推定量は単一の指数成分のみを考慮し、これ以上は説明しません。
単一分子イベントの 2 次元ヒストグラムでは、平均蛍光寿命 (τ) と異方性 (rxy) をペリンの式29,61 で関連付けて、平均回転時間 (ρ) を求めることができます。
<img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq08.jpg" style="margin: auto;">(3)
特定のρ 値は、異なるバーストの光子が結合された時間分解蛍光異方性崩壊に統合される「サブアンサンブル」(se)解析によって、より高い確実性で取得できます。これは、式2のパラメータを実験的減衰(seTRFA)に最適化することで解析できます。時間分解異方性は、ns時間枠内で発生する蛍光の放出内の生体分子の回転運動(局所的および全体的)に関連する不均一性とダイナミクスを解くことができます。
単一分子イベント内のダイナミクス(サブミリ秒スケール)を検出するために、時間分解異方性バースト分散解析(traBVA)57を導入した。traBVAでは、Mi連続光子セグメントを含む光子バーストの場合、バーストの過剰異方性分散(s2)は次式で表されます
<img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq09.jpg" style="margin: auto;">.    (4)
単一の異方性状態の場合、分散σ2 は、ショットノイズ65 (sn: √N、ここで N は光子の数)のみから生じます
<img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq10.jpg" style="margin: auto;">(5)
ここで、m はバースト内の光子の数です。したがって、異方性のさらなる分散を特定するために、コンフォメーションの不均一性による過剰な異方性分散(S2)を式4と式5の差として定義できます。
<img alt="Equation 11" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq11.jpg" style="margin: auto;">(6)
個々の分子の観察内で発生するダイナミクスを捉え、分散近似を考慮するために、動的異方性光分布解析(daPDA)55,56を使用することができます。daPDAでは、蛍光強度は、二項分布として表される条件付き確率(<img alt="Equation 12" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq12.jpg" style="margin: auto;">)に従ってモデル化されます。
<img alt="Equation 13" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq13.jpg" style="margin: auto;">(7)
一緒に、ポアソン分布に従うバックグラウンドカウント率の推定値
<img alt="Equation 14" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq14.jpg" style="margin: auto;">(8)
ここで、<img alt="Equation 15" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq15.jpg" style="margin: auto;"> は、設定された時間枠あたりの背景フォトンの平均数です。平行および垂直のバックグラウンドカウント(<img alt="Equation 16" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq16.jpg" style="margin: auto;">と<img alt="Equation 17" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq17.jpg" style="margin: auto;">)は、バッファサンプルを基準として使用して測定できます。実験的に決定された蛍光異方性は、速度論的変化を含む偏光チャネルあたりの蛍光強度分布で性能指数χ2を最小化することによって最適化されます。
提供される分析ルーチンとデータ表現は、収集されたデータを解釈するための包括的なアプローチを提供します。このプロトコルは、ナノ秒からミリ秒までの異方性変化を捉えることに限定される共焦点測定に主に焦点を当てているが、より長い時間スケールで蛍光異方性を監視するために全反射顕微鏡を採用することが可能であり、時系列分析66を可能にする。単一分子共焦点測定では、観察されたアンサンブルのユニークなフィンガープリントを作成する多次元ヒストグラムの使用を強調します。選択した集団から再構築された時間分解蛍光減衰は、ナノ秒スケールで蛍光異方性の進化を追跡できます(図3)。光子分布解析55,56およびバースト分散解析(BVA)57,58も、時間分解崩壊と多次元ヒストグラムとの間の中間時間スケールでのダイナミクスを捉えることができる。このプロトコルは、ナノ秒からミリ秒のタイムスケールをブリッジすることができるパルス励起67,68の有無にかかわらず、偏光蛍光相関分光法(FCS)の使用をカバーしていないが、同じデータをFCS69を計算するために使用することができるが、これは提示されたプロトコルの範囲外である。このような実験を行う場合は、サンプル測定時間を長くすることをお勧めします。
このアプローチは、ヒトのFoxPタンパク質のような複雑なシステムに適用されており、その作用機序に関与する運動に関する貴重な洞察を提供しています。FoxPタンパク質は、脳や肺の発達など、いくつかの生理学的側面に関与する転写因子です。重要なことに、異なる突然変異がこれらのタンパク質の機能を損なうと認識されている70,71。FoxP1のDNA結合ドメインをモデルとして、異なる単一システイン変異体を作製し、運動のトラッカーとしてBODIPY-FL色素を導入しました(図4A)。実際、このタンパク質の主要な構造調節因子としての二量体化とDNA結合の影響を評価しました。smFAアプローチを使用して、2D-smFAプロットを生成し、単量体および二量体条件の各変異体に対してtraBVAおよびdaPDAを作成しました。研究された単一の変異体の1つの例を示します(図4)。異方性挙動は、高回転相関時間と低回転相関時間を決定する点ですべての変異体で類似しており、したがって、推定、無秩序、および折り畳まれたアンサンブルを決定します。それでも、各アンサンブルのフラクションと動力学の点ですべての変異体で非常に不均一であり、二量体化とDNA結合によって影響を受ける異なる秩序から無秩序への移行変化を証明し、鎖に沿った構造ダイナミクスの高解像度での記述を示しています(図5)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67802/67802fig01.jpg"> 
図1:生体分子のダイナミックレンジと蛍光異方性法。 (A)目的の生体分子の骨格に沿ったさまざまな位置につながれた小さな蛍光色素の異方性は、局所的な構造ダイナミクスを知らせます。(B)蛍光強度減衰(時間分解蛍光異方性、FA)および共焦点単一分子顕微鏡データの単一分子ヒストグラムによってプローブされた時間スケール。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67802/67802fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67802/67802fig02.jpg"> 
図2:1分子蛍光異方性データの登録と処理。 (A)自由に拡散する分子を、直線偏光レーザー(我々の場合は青色)を1本搭載した共焦点1分子顕微鏡で解析します。蛍光発光(この場合は緑色)は、ビーム偏光子が信号を2つの偏光(平行、 <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq18.jpg" style="margin: auto;">、励起源に対して垂直 <img alt="Equation 19" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq19.jpg" style="margin: auto;">)に分割した後、2つの検出器によって検出されます。(B)検出された各光子は、マイクロ時間、マクロ時間、チャネルタイプの3つのパラメータによって特徴付けられます。データは、Time-Tagged Time-Resolved(TTTR)フォーマット72で格納される。(C)個々の分子のバーストを選択し、処理して、観察された各分子の蛍光異方性を含む蛍光パラメータを抽出します。(D)データは、蛍光異方性対蛍光寿命の2次元プロットや時間分解異方性減衰など、複数の方法で表されます。これらの表現により、蛍光寿命、回転相関時間、およびシステムの不均一性を視覚的および定量的に決定できます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67802/67802fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67802/67802fig03.jpg"> 
図3:FoxP1ドメインスワップダイマーの代表データ。 (A)蛍光異方性(r散乱)と分子あたりの平均蛍光寿命との相関を等高線プロットとして。分子のアンサンブル平均の代表として、2つの回転成分に対する1つのペリン方程式を重ね合わせたもので、ρ1 と ρ2 がそれぞれ 0.2 ns と 8.5 ns であることを考慮したものです。(B)サブアンサンブル時間分解蛍光減衰を使用して、サンプルの時間分解蛍光異方性を計算します。式2と適合すると、蛍光異方性の局所成分と全体成分が分離されました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67802/67802fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67802/67802fig04.jpg"> 
図4:単一分子蛍光異方性(smFA)を使用してモニターされたサブミリ秒のFoxP1ダイナミクス。 (A)単量体のFoxP1構造の漫画表現。(B)2次元ヒストグラムは、動的不均一性を示し、時間分解蛍光異方性によって特定された2つの異なる回転相関時間を明らかにします。時間分解異方性バースト分散解析(traBVA)は、大きな異方性を示す過剰分散(式6)を持つイベントの小さなサブセットを明らかにします。Photon Distribution Analysis(PDA)を用いた定量的動的異方性解析により、このプロセスの為替レートをさらに抽出します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67802/67802fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67802/67802fig05.jpg"> 
図5:二量体化中のFoxP1の局所的および全球的な動きのスクリーニング (A)漫画の表現は、単量体のFoxP1とその二量体形態を比較します。(B)単量体および二量体条件下での位置ごとの平均過剰分散が示されており、過剰分散が大きいほど異方性の変化が有意であることを示しています。(C)光子分布解析(PDA)を用いた動的異方性解析は、DNAの不在(緑)と存在(黄)における集団分率(暗い色で高い異方性、明るい色で低い異方性)を決定するのに役立ちます。このアプローチでは、ローカルな行動とグローバルな行動の間の遷移について、示されていない率を推定し、FoxP1が部分的な展開を遂げていることを明らかにしました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67802/67802fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

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