生体分子の局所柔軟性を特徴付けるための単一分子からの時間分解蛍光異方性
2025年4月25日
ここでは、共焦点顕微鏡モードで単一分子レベルでの時間分解蛍光異方性を使用して、生体分子の局所的な柔軟性とダイナミクスを研究するためのプロトコルを紹介します。
この研究は、共焦点顕微鏡モードでの時間分解蛍光異方性を使用して、単一分子レベルでの生体分子の局所的な柔軟性とダイナミクスを研究することを目的としています。単一分子の検出と局在化により生体分子の観察が可能になりましたが、そのダイナミクスを捉えるには他のアプローチが必要です。時間分解蛍光法は、そのギャップを埋めるのに役立ちます。
単一分子フレットやNMRを含む生体分子動力学を実験的に研究するための一般的なツール。単一分子レベルでは、光子蛍光発光による光子の各種分析、プロセス、時間分解分析、バースト分散分析などがあります。
smFRET実験に複数の蛍光色素を使用すると、実験計画や十分な品質のサンプルの作成に複雑さが生じる可能性があります。単一のラベルと蛍光異方性を使用すると、これらの複雑さの一部が解決されます。
ヒトFoxP1のフォークヘッドドメインの単量体型は、無秩序なタンパク質として振る舞い、二量体化すると折り畳み集団が増加することを発見しました。
[講師]まず、調製した標準緩衝液を0.22マイクロメートルの細孔径フィルターでろ過します。次に、標準バッファーを木炭フィルターでろ過し、単一分子を取得します。蛍光プローブの場合は、調製したBODIPY Fluorescent Proの少量のアリコートを調製します。偏光分解セットアップのキャリブレーションを行うには、まず、平行および垂直の検出器チャネルをオンにし、青色レーザーの電源を入れます。レーザー出力が 60 マイクロワットに設定されていることを確認し、時間相関単一光子計数または TCSPC ソフトウェア コントロール パネルを開きます。次に、1マイクロリットルの100ナノモルのローダミン110を49マイクロリットルの蒸留水と混合します。顕微鏡の対物レンズの上に浸漬液を一滴加えます。カバーガラスを顕微鏡の対物レンズに置き、水滴がレンズの中心にあることを確認します。キャリブレーション測定のために、希釈したローダミン110溶液をカバーガラスの中央に50マイクロリットル加えます。イメージ平面を溶液の内側とガラス表面の上になるように調整します。フォーカスノブを使用して、2番目の明るい焦点を見つけ、1 1/2回転に調整します。次に、ソフトウェアをTime-Tagged Time-Resolvedモードで開き、[START]ボタンをクリックします。カウント率を120秒間記録します。バックグラウンド測定の場合は、カバーガラスの中央に50マイクロリットルの蒸留水を加え、取得を繰り返します。フォトンカウントレートを300秒間記録し、ファイルをwater.ptuとして保存します。追加のバックグラウンド測定を行うには、カバーガラスの中央に50マイクロリットルの標準バッファーを追加します。フォトンカウントレートを300秒間記録し、ファイルをstandard_buffer.ptuとして保存します。次に、Burst Integration Fluorescence Lifetime、BIFL、分析ソフトウェアを起動し、自動ウィンドウから[セットアップの確認]をクリックします。次に、「ファイルからパラメータを取得」をクリックし、「OK」をクリックします。解析する測定値を選択するには、[データパス配列]をクリックし、適切なデータセットを選択します。次に、Green Scatter などの配列の水測定 water.ptu ファイル、Green 背景の standard_buffer.ptu ファイル、Green thick の Rhodamine110.ptu ファイルをロードします。[Single Molecule selection parameters] で、[Next]、[Adjust] の順にクリックして、新しいポップアップウィンドウを開きます。次に、しきい値を押して光子間到達時間を変更し、平均光子間到達時間として単一分子イベント時間を選択します。次に、最小数をクリックして、単一分子イベントあたりの光子の最小数を設定します。次に、[Return]と[OK]をクリックしてポップアップウィンドウを閉じます。[カラーフィットパラメータ]をクリックして、蛍光減衰パラメータを使用して緑色やその他の色の初期蛍光寿命を調整します。from と to の値を調整して値を変更、プロンプト、および遅延し、ポップアップ ウィンドウを閉じます。最後に、[保存] を押して ASCII ファイルを処理し、選択したフォルダーに保存します。大腸菌C41の一晩の前接種物を、抗生物質を1:500の希釈比で事前に添加した500ミリリットルのLB培地に移します。培養物の吸光度を600ナノメートルで測定して、培養物の成長を監視します。光学密度が0.5〜0.7に達したら、IPTGを最終濃度0.5ミリモルまで添加してタンパク質発現を誘導し、インキュベートします。培養物が1.4〜1.6の光学密度に達したら、細菌細胞を摂氏4度で20分間3,000 gで遠心分離します。上清を廃棄した後、ペレットは使用までマイナス20°Cで保管してください。次に、50〜100マイクロモルのFoxP1タンパク質をDTTまたはTCEPのいずれかの10倍のモル過剰に添加し、インキュベートします。バッファー交換用のカラムアダプターを使用して、PD-10脱塩カラムを50ミリリットルの遠心分離管に入れます。平衡化のために5ミリリットルのPBSバッファーをカラムに加え、1,000 gで2分間遠心分離します。PD-10カラムを新しい50ミリリットルのチューブに移し、2ミリリットルのPBSバッファーをカラムに加えます。次に、500マイクロリットルのFoxP1タンパク質をカラムにロードします。 1,000 gで2分間遠心分離してカラムを溶出し、精製したタンパク質を回収します。タンパク質を10キロダルトンの分子量カットオフ超遠心フィルターに移します。7,500gで10分間遠心分離した後、濃縮溶出液を回収します。タンパク質濃度を測定します。次に、BODIPYを加え、回転器で摂氏4度で2時間インキュベートします。バッファー交換とタンパク質濃縮を繰り返します。タンパク質濃度を決定した後、式を使用して標識の程度を測定します。495マイクロリットルの超純水と5マイクロリットルのトゥイーン20をチャンバースライドのウェルに加え、よく混合します。室温で30分間インキュベートした後、チャンバーを超純水で2回穏やかに洗浄し、乾燥させます。バックグラウンド蛍光を補正するには、緩衝液の測定を行います。高速回転色素からデータを取得することにより、平行および垂直検出器の相対感度を較正します。単量体FoxP1の単分子蛍光異方性実験では、チャンバースライドに500マイクロリットルの標準バッファーに100ピコモルのBODIPY標識FoxP1および100ナノモルの非標識FoxP1を加えます。測定を開始し、BIFLソフトウェアで30秒以内に記録されたバーストの数が60〜90であることを確認します。サンプルの濃度が高い場合は、バーストカウントがこの範囲内になるまで希釈します。最後に、測定値を分析します。単一分子蛍光異方性寿命分析により、FoxP1 DNA結合ドメインにおける2つの異なる回転相関時間に由来する単一の分布が明らかになり、秩序ある構造アンサンブルと無秩序な構造アンサンブルの共存が示唆されました。バースト分散解析により、高い異方性と過剰な変異体を示すFoxP1分子のサブセットが同定され、動的なコンフォメーション変化の存在が示唆されました。光子分布解析により、単量体と二量体のFoxP1状態が区別され、明確な異方性分布と交換率が示されました。二量体化はFoxP1の局所的および全体的な動きに影響を与え、過剰分散測定は特定のシステイン標識部位での有意な異方性変化を示しました。動的異方性解析により、FoxP1 は二量体化と DNA 結合時に部分的に展開され、構造化された集団と無秩序な集団の割合が変化することが明らかになりました。
概要
本研究では、共焦点顕微鏡モードにおける時間分解蛍光異方性を用い、単分子レベルでバイオ分子の局所的な柔軟性とダイナミクスを調査するためのプロトコルを提示します。この手法により、バイオ分子の挙動とダイナミクスの詳細な観察が可能になります。
研究の主要構成要素
科学分野
- 生体分子ダイナミクス
- 蛍光顕微鏡法
- 単分子解析
背景
- 単分子検出により、生体分子の観察が可能になります。
- 時間分解蛍光法は、生体分子のダイナミクスを捉えるために不可欠です。
- 複数の蛍光色素を用いた実験では、複雑な問題が生じます。
- 蛍光異方性は、実験設計を簡素化します。
研究の目的
- 生体分子の局所的な柔軟性を研究すること。
- 単一分子レベルで生体分子のダイナミクスを解析すること。
- 時間分解蛍光異方性を利用して詳細な観察を行うこと。
使用された手法
- 標準緩衝液および蛍光プローブの調製。
- 偏光分解能セットアップの校正。
- 単一分子蛍光寿命解析。
- タンパク質の発現および精製技術。
主な結果
- FoxP1タンパク質の単量体形態は、天然変性タンパク質として振る舞う。
- FoxP1の二量体化により、フォールディングした分画が増加する。
- 時間分解蛍光異方性は、生体分子のダイナミクスに関する知見を提供する。
- 実験的手法により、単一分子解析のための信頼性の高いデータが得られる。
結論
- 本プロトコルは、生体分子のダイナミクスを効果的に捉えることができます。
- 蛍光異方性は、タンパク質の挙動を研究するための有用なツールです。
- 単一分子技術は、生体分子の柔軟性に関する理解を深めます。
よくある質問
業界における実用的な関連性
時間分解単一分子蛍光異方性測定により、バイオ分子における局所的な柔軟性とコンフォメーションダイナミクスの直接的な定量化が可能となり、初期創薬におけるメカニズム的なリスク低減における重要な課題が解決されます。転写因子FoxP1における秩序構造と無秩序構造の集団を解明することで、このアプローチはターゲットバリデーションにおける予測の信頼性を高め、ポートフォリオの優先順位付けに関する意思決定に寄与します。単一分子レベルで動的な状態を区別できる本手法の能力は、リード化合物同定の前段階における、より堅牢な生物学的特性評価を可能にします。
バイオファーマR&Dにおける戦略的応用
初期創薬およびターゲットバリデーション
- 標的タンパク質におけるコンフォメーションの不均一性と動的な遷移の直接的な解析を可能にする。
- 生物学的活性に関連する秩序状態と無秩序状態を区別することで、機能的な標的バリデーションをサポートする。
- 標的結合および二量体化の根拠となるメカニズム的な仮説に対する予測の信頼性を向上させる。
- パイプラインの早期段階で構造的なリスクを明確にすることで、ポートフォリオの優先順位付け（トリアージ）を促進する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- ダウンストリームのアッセイ開発およびスクリーニングワークフローに向けた、検証済みの単一分子リードアウトを提供します。
- 局所的な柔軟性と動的な交換速度の、定量的かつ再現可能な測定を可能にします。
- コンフォメーション動的なタンパク質を標的とした化合物評価のための、生物物理学的アッセイの標準化をサポートします。
- 多色蛍光標識法と比較して複雑さを軽減し、アッセイのセットアップとデータ解釈を効率化します。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 構造ダイナミクスのデータを疾患関連メカニズムと整合させ、トランスレーショナルなバイオマーカーの開発を促進します。
- さまざまな条件下でのコンフォメーション状態を追跡することで、探索段階から前臨床バリデーションまでの連続性をサポートします。
- 治療標的の定量的なダイナミックプロファイルに基づき、リスクを調整した進展決定を可能にします。
- 疾患に関与する固有不規則領域（intrinsically disordered regions）を持つ標的に対し、メカニズムに基づいたリスク低減を提供します。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法は、初期の仮説検証からリード化合物の同定に至る創薬の連続的なプロセスに組み込まれており、標的タンパク質の生物物理学的特性評価のための再利用可能なプラットフォームを提供します。
- 探索生物学：動的な構造アンサンブルを解明することで、仮説検証およびパスウェイの明確化を支援します。
- スクリーニング：定量的な再現性のある異方性出力を提供し、アッセイの準備および化合物の選別を可能にします。
- 分析：モノマー状態とダイマー状態、交換速度、および構造的な不均一性の統計的な比較を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ：関連する場合、動的な構造データを疾患メカニズムやバイオマーカー戦略へと結びつけます。
- エンタープライズ再利用：さまざまなターゲットにおける単一分子生物物理学的解析のための、標準化され拡張可能なワークフローを構築します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：標的バリデーションにおける予測の信頼性を高め、メカニズム的な曖昧さを軽減します。
- 運用的価値：ダイナミック生物物理学的アッセイの標準化、再現性、およびスケーラビリティを向上させます。
- 戦略的価値：構造的リスクを早期に明確にすることで、Go/No-Go判断と資本効率を改善します。
- ポートフォリオへの影響：構造的に複雑な標的に対して、リスク調整後の優先順位付けと推進を可能にします。
実施上の検討事項
- 単一分子蛍光および時間分解異方性解析の専門知識が必要です。
- 共焦点顕微鏡、偏光分解検出、および高度な解析ソフトウェアへのアクセスが求められます。
- 再現性のある出力を得るためには、厳密な校正とチーム間での標準化が必要です。
- 標的タンパク質に応じて、ラベル化およびバッファー条件の最適化が必要になる場合があります。
- 動的な不均一性の解釈は、堅牢な統計解析に基づいている必要があります。
