ラットのための直接迷走神経注射プロトコル

遺伝子置換療法の前臨床試験を行っています。実験動物を用いて、自律神経系や末梢神経系の問題に対処するための最適なドラッグデリバリー方法を確立しています。ベクターベースの遺伝子置換療法は、遺伝子治療における新興技術の 1 つです。アディノ関連ウイルスベクターの応用は、現在利用可能な潜在的な選択肢の1つです。AAV9 は、目的の遺伝子を中枢神経系および末梢神経系に送達するために、遺伝子治療研究で広く使用されています。研究者には、末梢神経系に直接薬剤を送達するための十分な選択肢がありません。末梢神経や自律神経によって引き起こされる神経障害を伴う状況があります。しかし、これらの状況に対処するための効果的な薬物送達方法が不足しています。

この方法は、ラットを用いた前臨床試験において、自律神経系の問題に対処するために迷走神経に直接薬剤を送達する方法を示しています。さらに、この方法は、他の種で必要な修飾を加えて、他の末梢神経を介して薬物を送達するために輸出することができます。グレイラボは、げっ歯類と大型動物の両方を使用したAVを介した前臨床遺伝子治療研究を継続します。さらに、遺伝子置換療法の戦略を開拓するために適用できる新しい方法の開発にも注力しました。

[ナレーター]まず、プランジャーを取り外した 100 マイクロリットルのガラス注射器を 27 ゲージの針に接続します。約 45 センチメートルの滅菌ポリエチレン チューブの一端を 27 ゲージの針に接続し、3 ミリリットルのプラスチック注射器に 27 ゲージの針を取り付け、約 0.5 ミリリットルの 0.9% 生理食塩水を注射器に装填します。0.9%の生理食塩水を使用して、開いた端からポリエチレンチューブを充填し、チューブの全長を確保し、生理食塩水が溢れるまでガラスシリンジのバレルを充填します。完了したら、3ミリリットルの注射器とその針を取り外して廃棄します。次に、プランジャーをガラスシリンジのバレルに挿入し、バレルの中央まで少し前方に押し込み、ガラスシリンジをシリンジポンプに入れます。シリンジ ポンプを使用してプランジャーを少し後ろに引き、チューブの開いた端に約 1.5 センチメートルの空域を作成します。滅菌されたパラフィルム片に、少なくとも5マイクロリットルの色素と10マイクロリットルのマイクロピペットを使用して候補薬物混合物をピペットで移動させます。シリンジポンプを使用して候補薬物混合物をチューブに引き出し、注射混合物のレベルをマーカーでマークします。35ゲージの針をチューブに取り付け、テープで手術ステージのきれいな表面に固定し、固定され、滅菌され、他のものに触れないようにします。注射液が針先から出始めるまで、シリンジポンプを10〜15秒間始動します。麻酔をかけたラットを脱毛と部位の準備のための設備を備えたテーブルに移します。過度の乾燥を防ぐために、ラットの両目に人工涙液軟膏を塗布します。ラットが意識を取り戻したときに痛みを制御するために、承認された施設の動物プロトコルに従って鎮痛薬を投与します。頸部の首の腹側を剃り、あごから胸骨まで両側の正中線から垂直に約2センチまで伸ばします。70%のエチルアルコールと10%のベタジンで3回滅菌し、円形に外側に拭き取りました。解剖顕微鏡下で仰臥位でラットを手術段階に移します。ラットの下の加熱パッドが適切に焼き戻されていることを確認し、手術のために頸部領域を視覚化するように焦点を合わせた顕微鏡を調整します。ラットを引っ掛けるか、非吸収性縫合糸で顎の歯を引っ掛けます。縫合糸の開いた端をノーズコーン内に固定して、麻酔中ずっと鼻孔をノーズコーン内に保ちます。ラットの頭が右利きの外科医の左側に置かれるようにラットを配置します。滅菌したガーゼクッションを首の下に置き、位置を合わせ、頸部をまっすぐにします。ラットの体を滅菌ドレープで覆い、手術領域を露出させたままにします。手術ステージの四隅に磁気固定器で4つのリトラクターピンを固定します。次に、局所麻酔薬を注入します 切開が行われる頸部領域の正中線に表皮。メスの刃を使用して、腹側頸部のあごと胸骨の間の正中線に2センチメートルの縦方向の皮膚切開を行います。次に、滅菌した綿の先端で、切断された皮膚の端を鈍く分離します。リトラクターの先端を使用して、分離された皮膚の端を反対方向に引っ込めます。綿の先端を使用して筋膜を分離して深く入り、唾液腺を横方向に押します。次に、胸骨乳様突起の筋肉を綿の先端で分離し、リトラクターピンで横方向に引っ込めます。頸動脈鞘が見えるまで、気管の左側で組織を分離し続けます。細い鉗子を使用して、頸動脈を損傷することなく頸動脈鞘に小さな穴を作り、左迷走神経を総頸動脈から慎重に分離します。鉗子を使用して神経を動脈から分離したら、1ミリリットルの注射器に取り付けられた25ゲージの湾曲した針を使用して引っ掛け、利き手ではない手で神経を保持します。 薬剤染料混合物候補を充填した針を利き手で持ちます。スムーズな刺し傷を容易にするために、25ゲージのフックを使用して神経をそっと引っ張って神経をまっすぐに保ちます。針を神経に挿入し、迷走神経と平行に針を保ちながら0.5センチ以上前方に進めます。針の約0.4〜0.5センチメートルが神経の内側に残るように少し後ろに引っ張ります。1本の針で神経を刺す回数を3回以下に制限してください。針の挿入を確認した後、動かさずにその位置を保ち、シリンジポンプの電源を入れます。注入を監視して、神経内にとどまり、スムーズに流れることを確認します。輸液チューブのマークされた点を使用して、薬物色素混合物の動きを追跡します。神経が染料の色を発達させ始めるのを観察します。25ゲージの湾曲した針を取り外し、滅菌綿の先端を使用して、ティッシュを元の位置にそっと戻します。次に、リトラクターの先端を取り外します。吸収性または非吸収性の縫合糸で傷を閉じ、必要に応じて縫合の間に少量のティッシュ接着剤を塗布して、傷が完全に閉じるようにします。