クライオ切片による ショウジョウバエ の心臓蛍光染色のための新規で効率的な方法

私の研究室では、ショウジョウバエモデルを使用して老化と代謝障害を研究し、代謝、心筋、睡眠、その他の老化疾患の介入として時間制限のある摂食と運動を探求しています。機械学習とオミクス、生理学的、遺伝的、栄養的戦略により、3Dプリントされたデバイスと機械学習アプローチを使用してショウジョウバエのアッセイを効率化しています。ショウジョウバエの心臓の蛍光免疫組織化学は、遺伝子型や年齢を問わず多タンパク質の検出を可能にしますが、複雑な解剖、組織の保存、特定のタンパク質発現パターンの高解像度イメージングなどの課題に直面しています。

このプロトコルにより、組織の保存、抗体の浸透性、イメージングの分解能が向上し、心筋タンパク質マーカーの可視化が向上します。複雑な解剖、組織の損傷、従来の全心マウント法における限られた分解能などの課題に対処します。このプロトコルは、複雑な解剖を排除し、片手での実行を可能にし、高価な共焦点顕微鏡法を回避することで、ショウジョウバエの心臓研究のアクセシビリティを向上させ、高解像度イメージングをより実現可能にします。

まず、二酸化炭素フライマットを使用して5〜10匹のハエに麻酔をかけます。顕微鏡で1倍から2倍の倍率でハエを視界内に配置します。スプリングハサミを使用して、ハエの首を切り落とし、翼をクリップし、脚を取り除きます。

胸部と腹部を一緒に保持し、体と呼びます。ブラシを使用して、すべての実験グループが収集されるまで、氷上のラベル付きの1.5ミリリットルチューブに体をそっと置きました。チューブを氷から取り出した後、pH 8の100マイクロリットルのエチレングリコール四酢酸を各チューブに加えます。

すべての物体が水没していることを確認し、チューブをオービタルシェーカーに10分間置きます。次に、エチレングリコール四酢酸溶液をチューブから取り出して廃棄します。各チューブに100マイクロリットルのPBSをピペットで入れて、ティッシュを10分間洗浄します。

洗浄プロセス中にチューブをオービタルシェーカーに置きます。PBSを廃棄した後、PBS溶液中の4%パラホルムアルデヒド100マイクロリットルを各チューブにピペットで入れます。チューブを100ユニットのオービタルシェーカーに15分間置き、組織が溶液と接触したままになるようにします。

その後、パラホルムアルデヒド溶液を捨てます。最終的な洗浄が完了したら、体をPBSの10%スクロースの溶液に移します。本体がチューブ内の溶液と接触していることを確認します。

保管場所からドライアイスを取り出し、小さな金属製またはプラスチック製のトレイに入れるためにいくつかのピースを選択します。型を挿入できる寸法のトレイを選択し、大きくて平らなドライアイスの1つの上に直接置きます。ラベル付きの金型を最適な切断温度またはOCTコンパウンドで50%まで充填し、泡を最小限に抑えるためにゆっくりと注ぎます。

ブラシを使用して、解剖して固定したショウジョウバエの体を金型内のOCT化合物の表面に慎重に置きます。鉗子を使用して、胸部と腹部の背壁が一般的に底に沿って整列するように、各体を型の底に押し込みます。腹部が金型の底に沿って平らになるように体を調整します。

すべてのボディをX、Y、Z寸法に位置合わせして、各セクションにすべての被写体が同時に含まれるようにします。腹部の湾曲を矯正し、特に男性の場合は、体に穴を開けたり押しつぶしたりせずに、できるだけ平らにします。すべての被写体が配置されたら、底がドライアイスの真上にくるように型を配置します。

OCTコンパウンドが接触すると凍結し始めることを確認し、すべての被験者が金型に完全に包まれるまで続けます。凍結後、金型をマイナス20°Cに設定された冷凍庫に移し、全体で完全に凍結させます。完全に凍結したら、金型の残りの部分にOCTコンパウンドを充填します。

金型にチャックビットを取り付けるには、ブロックにOCTコンパウンドをたっぷりと塗布します。ビットをコンパウンドに平らに押し付け、クライオスタット内で通常5分以内に完全に凍結させます。次に、チャックビットとOCTブロックを金型から外します。

ビットをチャックに入れ、ブロックが上から下に適切な向きを保っていることを確認し、チャックキーを締めてビットを固定します。次に、調整ノブとチャック深さコントロールを使用して、ブロックをブレードに合わせ、セクション幅を20マイクロメートル以下に設定します。ゆっくりとした一貫した動きでブロックから各スライスを切り取り、アンチロールガラスが各スライスをカットするときにキャプチャできるようにします。

温めたスライドを使用してセクションを収集します。かみそりの刃で、セクションを囲む余分なOCT化合物を取り除きます。疎水性マーカーを使用して各スライドの境界線を描き、洗浄液と染色液を組織に閉じ込めます。

1000マイクロリットルのピペットを使用して、スライドをPBSで3回、ティッシュに触れずに5分間ずつ洗浄します。最終洗浄液を廃棄した後、蛍光染色液を組織にピペットで移し、暗所で室温で1時間インキュベートします。次に、蛍光染色を捨て、スライドをPBSでそれぞれ5分間3回洗浄します。

その後、最終的なPBS洗浄を廃棄し、スライドに少量の溶液を残します。1000マイクロリットルのピペットを使用して、3〜5滴の封入剤をスライドにピペットで固定し、組織に直接塗布しないようにします。鉗子を使用して、カバースリップを一方の端に配置し、スライドと同じ高さになるまでもう一方の側を徐々に下げます。

ネオンやグリッターのないマニキュアでスライドをシールします。封入剤が硬化しない場合は、蛍光染色にもよりますが、すぐにイメージングするか、スライドを後で使用するために保存してください。イメージングする前に、スライドの清浄度を検査し、70%エタノール水溶液を含ませたティッシュワイプを使用してスライドを優しく洗浄します。

実験内で最も明るい蛍光を発する被験者を分析し、各蛍光チャンネルに適切な露光時間を選択します。すべてのチャンネルのライブビューで各実験グループを調査し、正しい露出設定を確認します。一貫性を保つために、同じ蛍光チャネルを使用して各被写体に焦点を合わせ、すべての被写体の画像をキャプチャします。

イメージング後、スライドを暗所で摂氏4度で保存し、後で画像を再取得します。蛍光イメージング法は、オスティア、弁、縦線維、円周線維など、ショウジョウバエの心臓の主要な特徴を保持していました。心臓管全体の構造と詳細な微細な構造を異なる倍率で捉え、全体の構造を10倍、円周収縮線維や縦方向の安定化線維など、より細かい詳細を示す40倍から60倍の拡大率で撮影しました。

代表的な蛍光顕微鏡写真では、DAPI染色された核、緑色に染色された脂質、およびファロイジンで赤色に染色されたアクチン含有筋原線維を持つw1118ショウジョウバエの保存された心臓構造が示されました。ファロイジン染色は、縦方向および円周方向の繊維を効果的に強調し、凍結や切片化ストレスにもかかわらず保存されたアクチンフィラメント構造を示しました。脂質スポット染色により、心臓管の近くに脂肪が蓄積していることが明らかになりました。