Name: クライオ切片による ショウジョウバエ の心臓蛍光染色のための新規で効率的な方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-28T14:40:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: 学ぼう、ショウジョウバエの心臓蛍光染色法をクライオ切片と免疫組織化学で。複雑な解剖を不要にし、組織保存と抗体浸透を改善して高解像度イメージングを実現する革新的プロトコルです。

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<ol><li>Baker, K. D., Thummel, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetic+larvae+and+obese+flies-emerging+studies+of+metabolism+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Diabetic larvae and obese flies-emerging studies of metabolism in Drosophila.</a> Cell Metab. 6 (4), 257-266 (2007).</li>
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<li>Melkani, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntington%27s+disease-induced+cardiac+amyloidosis+is+reversed+by+modulating+protein+folding+and+oxidative+stress+pathways+in+the+Drosophila+heart%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Huntington's disease-induced cardiac amyloidosis is reversed by modulating protein folding and oxidative stress pathways in the Drosophila heart.</a> PLoS Genet. 9 (12), e1004024(2013).</li>
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<li>Mery, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+muscle+LIM+protein%2C+Mlp84B%2C+is+essential+for+cardiac+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">The Drosophila muscle LIM protein, Mlp84B, is essential for cardiac function.</a> J Exp Biol. 211 (1), 15-23 (2008).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1000 &マイクロ;L ピペット</td><td>Eppendorf</td><td>3123000063</td><td></td></tr><tr><td>1000 & micro;L ピペットチップ</td><td>Olympus Plastics</td><td>23-165R</td><td></td></tr><tr><td>10X リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)</td><td>Fisher</td><td>J62036.K7</td><td>ph=7.4</td></tr><tr><td>200 プルーフ エタノール</td><td>Decon Laboratories</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>20X Tris Buffered 生理食塩水</td><td>Thermo Scientific</td><td>J60877.K2</td><td>pH=7.4</td></tr><tr><td>アンチロールガラス</td><td>IMEB</td><td>AR-14047742497</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>フィッシャー</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>遠心チューブ 1.5 mL</td><td>フィッシャー</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>チャージスライド</td><td>グローブサイエンティフィック</td><td>1415-15</td><td></td></tr><tr><td>クライオセクショニングモールド</td><td>フィッシャー</td><td>2363553</td><td></td></tr><tr><td>クライオスタット</td><td>ライカ</td><td>CM 3050 S</td><td></td></tr><tr><td>クライオスタット ブレード</td><td>C.L. スターキー</td><td>DT554N50</td><td></td></tr><tr><td>ドライアイス</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ファイン フォーセプス</td><td>ファイン サイエンス ツール</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>フライ パッド</td><td>Tritech Research</td><td>MINJ-DROS-FP</td><td></td></tr><tr>Dapi <td>Vectashield</td><td>H-1800</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td> Kimtech による硬化封入剤<td></td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡</td>オ<td>リンパス</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>最適な切断温度コンパウンドフィ</td><td>ッシャー4585</td><td></td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド20%</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>15713</td><td></td></tr>ファ<tr><td>ロイジン594</td><td>アブノバ</td><td>U0292</td><td></td></tr>カ<tr><td>ミソリの刃グレイ</td><td>ビー</td><td>#40475</td><td></td></tr><tr><td>春はさみ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>15000-10</td><td></td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>フィ</td><td>ッシャーS5-500</td><td></td></tr></tbody></table>

クライオ切片による ショウジョウバエ の心臓蛍光染色のための新規で効率的な方法

Novel And Efficient Method for Drosophila Heart Fluorescence Staining with Cryosectioning

上記の方法は、面倒な解剖をせずに蛍光イメージングを使用して ショウジョウバエ の心臓の研究を容易にします。これがこの方法の主な利点であり、従来の心臓解剖法では複雑な運動能力の発達が必要です。 図1に示すように、この方法は新しい研究者にとって心臓解剖よりも親しみやすく、実験の柔軟性を可能にします。あるいは、OCT金型段階で-80°Cの保管を使用することで、試料を何週間も後で使用するために保管することができます。技術者は、簡単な解剖と埋め込みの技術を学ぶのに十分な期間訓練を受ける必要がないため、この方法は非常に利用しやすくなっています。
オスティア、弁、縦線維(支持線維)、円周線維(収縮性線維)などの ショウジョウバエ の心臓の顕著な特徴は、 図2でこの方法を使用して保存されていることが見られます。心臓の中核的な構造成分の保存は、老化や病的な状態において最も重要です。心臓の収縮構造を超えて、私たちの方法は、人間の肝臓<sup cla...

Drosophila heart models are widely employed in studying cardiac aging and modeling&#160;human cardiac diseases. However, the dissection of Drosophila ...

私の研究室では、ショウジョウバエモデルを使用して老化と代謝障害を研究し、代謝、心筋、睡眠、その他の老化疾患の介入として時間制限のある摂食と運動を探求しています。機械学習とオミクス、生理学的、遺伝的、栄養的戦略により、3Dプリントされたデバイスと機械学習アプローチを使用してショウジョウバエのアッセイを効率化しています。ショウジョウバエの心臓の蛍光免疫組織化学は、遺伝子型や年齢を問わず多タンパク質の検出を可能にしますが、複雑な解剖、組織の保存、特定のタンパク質発現パターンの高解像度イメージングなどの課題に直面しています。このプロトコルにより、組織の保存、抗体の浸透性、イメージングの分解能が向上し、心筋タンパク質マーカーの可視化が向上します。複雑な解剖、組織の損傷、従来の全心マウント法における限られた分解能などの課題に対処します。このプロトコルは、複雑な解剖を排除し、片手での実行を可能にし、高価な共焦点顕微鏡法を回避することで、ショウジョウバエの心臓研究のアクセシビリティを向上させ、高解像度イメージングをより実現可能にします。まず、二酸化炭素フライマットを使用して5〜10匹のハエに麻酔をかけます。顕微鏡で1倍から2倍の倍率でハエを視界内に配置します。スプリングハサミを使用して、ハエの首を切り落とし、翼をクリップし、脚を取り除きます。胸部と腹部を一緒に保持し、体と呼びます。ブラシを使用して、すべての実験グループが収集されるまで、氷上のラベル付きの1.5ミリリットルチューブに体をそっと置きました。チューブを氷から取り出した後、pH 8の100マイクロリットルのエチレングリコール四酢酸を各チューブに加えます。すべての物体が水没していることを確認し、チューブをオービタルシェーカーに10分間置きます。次に、エチレングリコール四酢酸溶液をチューブから取り出して廃棄します。各チューブに100マイクロリットルのPBSをピペットで入れて、ティッシュを10分間洗浄します。洗浄プロセス中にチューブをオービタルシェーカーに置きます。PBSを廃棄した後、PBS溶液中の4%パラホルムアルデヒド100マイクロリットルを各チューブにピペットで入れます。チューブを100ユニットのオービタルシェーカーに15分間置き、組織が溶液と接触したままになるようにします。その後、パラホルムアルデヒド溶液を捨てます。最終的な洗浄が完了したら、体をPBSの10%スクロースの溶液に移します。本体がチューブ内の溶液と接触していることを確認します。保管場所からドライアイスを取り出し、小さな金属製またはプラスチック製のトレイに入れるためにいくつかのピースを選択します。型を挿入できる寸法のトレイを選択し、大きくて平らなドライアイスの1つの上に直接置きます。ラベル付きの金型を最適な切断温度またはOCTコンパウンドで50%まで充填し、泡を最小限に抑えるためにゆっくりと注ぎます。ブラシを使用して、解剖して固定したショウジョウバエの体を金型内のOCT化合物の表面に慎重に置きます。鉗子を使用して、胸部と腹部の背壁が一般的に底に沿って整列するように、各体を型の底に押し込みます。腹部が金型の底に沿って平らになるように体を調整します。すべてのボディをX、Y、Z寸法に位置合わせして、各セクションにすべての被写体が同時に含まれるようにします。腹部の湾曲を矯正し、特に男性の場合は、体に穴を開けたり押しつぶしたりせずに、できるだけ平らにします。すべての被写体が配置されたら、底がドライアイスの真上にくるように型を配置します。OCTコンパウンドが接触すると凍結し始めることを確認し、すべての被験者が金型に完全に包まれるまで続けます。凍結後、金型をマイナス20°Cに設定された冷凍庫に移し、全体で完全に凍結させます。完全に凍結したら、金型の残りの部分にOCTコンパウンドを充填します。金型にチャックビットを取り付けるには、ブロックにOCTコンパウンドをたっぷりと塗布します。ビットをコンパウンドに平らに押し付け、クライオスタット内で通常5分以内に完全に凍結させます。次に、チャックビットとOCTブロックを金型から外します。ビットをチャックに入れ、ブロックが上から下に適切な向きを保っていることを確認し、チャックキーを締めてビットを固定します。次に、調整ノブとチャック深さコントロールを使用して、ブロックをブレードに合わせ、セクション幅を20マイクロメートル以下に設定します。ゆっくりとした一貫した動きでブロックから各スライスを切り取り、アンチロールガラスが各スライスをカットするときにキャプチャできるようにします。温めたスライドを使用してセクションを収集します。かみそりの刃で、セクションを囲む余分なOCT化合物を取り除きます。疎水性マーカーを使用して各スライドの境界線を描き、洗浄液と染色液を組織に閉じ込めます。1000マイクロリットルのピペットを使用して、スライドをPBSで3回、ティッシュに触れずに5分間ずつ洗浄します。最終洗浄液を廃棄した後、蛍光染色液を組織にピペットで移し、暗所で室温で1時間インキュベートします。次に、蛍光染色を捨て、スライドをPBSでそれぞれ5分間3回洗浄します。その後、最終的なPBS洗浄を廃棄し、スライドに少量の溶液を残します。1000マイクロリットルのピペットを使用して、3〜5滴の封入剤をスライドにピペットで固定し、組織に直接塗布しないようにします。鉗子を使用して、カバースリップを一方の端に配置し、スライドと同じ高さになるまでもう一方の側を徐々に下げます。ネオンやグリッターのないマニキュアでスライドをシールします。封入剤が硬化しない場合は、蛍光染色にもよりますが、すぐにイメージングするか、スライドを後で使用するために保存してください。イメージングする前に、スライドの清浄度を検査し、70%エタノール水溶液を含ませたティッシュワイプを使用してスライドを優しく洗浄します。実験内で最も明るい蛍光を発する被験者を分析し、各蛍光チャンネルに適切な露光時間を選択します。すべてのチャンネルのライブビューで各実験グループを調査し、正しい露出設定を確認します。一貫性を保つために、同じ蛍光チャネルを使用して各被写体に焦点を合わせ、すべての被写体の画像をキャプチャします。イメージング後、スライドを暗所で摂氏4度で保存し、後で画像を再取得します。蛍光イメージング法は、オスティア、弁、縦線維、円周線維など、ショウジョウバエの心臓の主要な特徴を保持していました。心臓管全体の構造と詳細な微細な構造を異なる倍率で捉え、全体の構造を10倍、円周収縮線維や縦方向の安定化線維など、より細かい詳細を示す40倍から60倍の拡大率で撮影しました。代表的な蛍光顕微鏡写真では、DAPI染色された核、緑色に染色された脂質、およびファロイジンで赤色に染色されたアクチン含有筋原線維を持つw1118ショウジョウバエの保存された心臓構造が示されました。ファロイジン染色は、縦方向および円周方向の繊維を効果的に強調し、凍結や切片化ストレスにもかかわらず保存されたアクチンフィラメント構造を示しました。脂質スポット染色により、心臓管の近くに脂肪が蓄積していることが明らかになりました。

novel-efficient-method-for-drosophila-heart-fluorescence-staining

Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

ここでは、幼虫および成体から心臓管の様々な要素の蛍光標識するための基本的なプロトコルを記述する...

の蛍光標識ショウジョウバエハートの構造

我々は、固定、包埋、切片、および後期のイメージングのためのプロセスについて説明...

の電子顕微鏡のための胚の調製ショウジョウバエ胎児心臓の管

我々は、特定の遺伝子型のショウジョウバエの胚の"フィレット"の準備を生成するための合理化プロトコルを記述する。このプロトコルは、遺伝子スクリーニングの様々な効率的な実行が可能になります。また、後期胚における構造物の優れた視覚化することができます。...

のライブ解剖ショウジョウバエ胚：抗体染色によってミュータントコレクションをスクリーニングするための合理化手法

筋肉の損傷のメカニズムの同定は非常に重要です。ここでは、ショウジョウバエの胸部筋肉のパラフィン包埋して凍結切片を調製するための組織学的手法を提示する。これは筋肉の形態やタンパク質と他の筋肉の細胞成分の局在の分析を行うことができます。...

のパラフィン包埋して凍結切片ショウジョウバエアダルトの筋肉

ここでは、ホールマウント蛍光を記述...

ホールマウントRNAを蛍光<em&gt;その場で</emの&gt;ハイブリダイゼーション<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;胚

免疫染色は、組織内の特定の細胞タイプやタンパク質を可視化するための効果的な技術です。超音波処理を利用することにより、ここに記載されているプロトコルは、免疫染色の前に後期胚および幼虫からショウジョウバエ・メラノガスター組織を解剖する必要性を軽減する。私たちは、ホルムアルデヒド固定全マウント幼虫の免疫染色のための効率的な方法を提供します。...

後期胚および幼虫の超音波処理により促進免疫蛍光染色<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;組織<em&gt;その場で</em

私たちは、無傷の胚および出生後の心臓の奥深くにある蛍光タンパク質標識細胞を体積的に画像化するプロトコルを記述します。組織透明化法とホールマウント染色を併用することで、胚性または出生後の心臓内の単一蛍光タンパク質標識細胞を鮮明かつ正確にイメージングすることができます。...

イメージングは​​、単一細胞の解像度で胚および出生後の心をクリア

蛋白質の集合とのショウジョウバエモデルの中枢神経系におけるオートファジーのフラックスの蛍光イメージングによる細胞生物学的研究から定量的なデータを抽出する単純なと適応のワークフローを開発しました。神経変性疾患。...

ImageJ を用いた蛍光タグ付きタンパク質の公平な分析によるショウジョウバエの神経変性の定量細胞生物学

ここでは、 ショウジョウバエ 胚タンパク質およびRNAの収集から事前包埋および包埋、免疫染色、およびmRNAin situ...

初期ショウジョウバエ胚における免疫組織化学およびRNAのその場分布のためのプロトコル

Expansion-Assisted Iterative Fluorescence In Situ Hybridization(EASI-FISH)は、拡大顕微鏡法と蛍光in...

Expansion-assisted iterative Fluorescence In Situ Hybridizationを用いたInsact Drosophila Brainにおける遺伝子発現のマルチプレックス検出

この研究では、斬首、固定、凍結切片、蛍光染色、免疫染色、およびイメージングを含む組織処理の簡略化されたプロトコルを提示します。これらは共焦点および多光子イメージングに拡張できます。この方法は、複雑な解剖に匹敵する有効性を維持し、高度な運動能力の必要性を回避します。定量的な画像分析は、広範な調査の可能性を提供します。...

脳蛍光染色および免疫染色を強化するための ショウジョウバエ 頭部の直接凍結切片

学ぼう、ショウジョウバエの心臓蛍光染色法をクライオ切片と免疫組織化学で。複雑な解剖を不要にし、組織保存と抗体浸透を改善して高解像度イメージングを実現する革新的プロトコルです。

クライオ切片によるショウジョウバエの心臓蛍光染色のための新規で効率的な方法

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クライオ切片による ショウジョウバエ の心臓蛍光染色のための新規で効率的な方法

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