赤身および肥満マウスからの初代マウス脂肪細胞の単離と培養

私たちの研究は、さまざまな脂肪貯蔵庫や食事条件からの成熟脂肪細胞の機能を調査することに焦点を当てています。私たちは特に、成熟した脂肪細胞が周囲の細胞とどのように通信するか、そしてこのクロストークが病気の進行にどのように影響し、肥満で変化するかを理解することに関心があります。成熟脂肪細胞は大きくてデリケートな細胞であるため、FACSなどの一般的に使用される細胞単離法は効果がありません。

さらに、脂肪組織によく見られる高レベルの遊離脂質は、成熟脂肪細胞に対して毒性があり、その維持を複雑にする可能性があります。前駆脂肪細胞のin vitro分化に依存する一般的に使用される方法とは対照的に、このプロトコルでは、機能的にも転写的にもin vivo脂肪細胞に似ているex vivo単離脂肪細胞を研究することができます。脂肪細胞は脂肪貯蔵庫間や食事条件によって大きく異なるため、これは特に重要です。

このプロトコルは、成熟した脂肪細胞を効率的に分離し、容易に拡張できます。異なる性別および異なる食事条件のマウスからの脂肪細胞の単離を最適化するための調整が含まれています。単離された脂肪細胞は、必要に応じて培養、画像化、またはその他の方法で使用することができます。

まず、コラゲナーゼ溶液1ミリリットルあたり0.00017グラムのDNaseを添加してDNaseを含むコラゲナーゼ溶液を調製し、混合物をボルテックスして完全に混合します。かみそりの刃を使用して、単離されたマウスの脂肪組織を均一に見えるまで細かく刻みます。次に、ミンチ組織を滅菌済みの50ミリリットルの円錐管に移します。

調製したコラゲナーゼとDNase溶液をミンチした脂肪組織に加え、最高速度で7〜10秒間ボルテックスして、成分を完全に混合します。次に、50ミリリットルの円錐管を220RPMに設定されたシェーカーに37°Cで10分間水平に置きます。インキュベーション後、チューブを取り外し、5秒間ボルテックスしてサンプルを確認します。

次に、血清学的ピペットを使用して、消化された組織をふるいにかけ、新しい滅菌50ミリリットルの円錐管に通します。組織とコラゲナーゼ溶液の量に等しいFBSをふるいを通して同じ円錐形チューブに追加して、コラゲナーゼを中和します。チューブを300Gで、ここに示す表に示されている温度で3分間回転させます。

次に、200マイクロリットルのピペットを使用して、遊離脂質の最上層を慎重に廃棄します。次に、先端を切り落としたP1000ピペットを使用して、成熟脂肪細胞を10ミリリットルの成長培地が入った準備した15ミリリットルのチューブに移します。成熟脂肪細胞を含む15ミリリットルのチューブを、白い層が培地全体に分散するまで3〜5回静かに反転させます。

チューブを10分間休ませた後、事前に決定した温度でチューブを回転させて、層をさらに分離します。その後、ピペットを使用して遊離脂質の最上層を廃棄します。次に、21ゲージの針を5ミリリットルの注射器に取り付け、針の底が成熟脂肪細胞部位層の下になるまで、針をチューブの端に慎重にスライドさせます。

次に、シリンジをゆっくりと引き上げて、培養培地と細胞の破片を取り除きます。チューブに10ミリリットルの培地を静かに加えます。ゲルローディングピペットチップの使用 チップをチューブの端にスライドさせて、成熟脂肪細胞層の下から残りの培地を取り除きます。

その後、細胞を100 Gで1分間遠心分離します。ピペットを使用して遊離脂質を取り除きます。ゲルローディングピペットチップを使用して、脂肪細胞の下の培地を取り除きます。

組織培養処理した24ウェルプレートから細胞培養インサートを取り出し、メンブレン面を上にしてフードの表面に置きます。プレートの交互のウェルを温かい培地で満たします。カットしたP200ピペットチップを使用して、30マイクロリットルの充填された成熟脂肪細胞をトランズウェルインサートの上部に移します。

次に、トランズウェルインサートを慎重に手に取り、反転させて、24ウェルプレートのプレフィルドウェルに入れます。ウェルからメディアを取り外すには、トランズウェルインサートをしっかりと保持し、側面の小さな開口部からP200ピペットで吸引します。メディアを取り出した後、トランズウェルを所定の位置に保持したまま、ウェルの側壁に沿って1ミリリットルの新鮮なメディアをゆっくりと追加します。