DNAテンションプローブの細胞内破壊と送達に基づく細胞メカノタイプのハイスループットフローサイトメトリー測定
2025年6月13日
この方法では、リガンドを提示する固定化されたDNA二本鎖を切断する細胞の傾向を測定して、相対的な細胞牽引力を報告します。破裂した蛍光オリゴを細胞内に送達し、フローサイトメトリーで解析して、細胞の機械的履歴を記録します。これにより、細胞メカノフェノタイピングの文脈で細胞力発生のハイスループット測定が可能になります。
私たちの研究室では、一般的に細胞が機械的刺激を伝えるための分子メカニズムを研究しています。最近では、細胞が周囲に及ぼす力をハイスループットで測定する手法を開発し、メカノバイオロジーをオミクス時代に持ち込んでいます。研究は、T細胞が正しい抗原によって活性化される方法と、幹細胞が特殊な細胞タイプに分化する方法に機械的な力が関係しています。
最近、調節不全の細胞力学の根底にあるプロセスを標的とすることが、疾患を治療する方法としてメカノセラピューティクスの開発につながっています。DNA二本鎖センサーとヘアピンセンサーは細胞外力を測定し、遺伝的にコードされたセンサーは細胞内測定を可能にします。そのほとんどがハイエンドの顕微鏡を必要としています。
牽引力顕微鏡は、細胞が周囲に及ぼす力を測定できますが、それも高解像度のイメージングを伴います。本研究では、イメージングの代わりにフローサイトメトリーを用いて力測定を行うこと、2つ目はHOHタグ技術を用いてリガンドや抗体をDNAプローブに付着させること、3つ目は特殊な表面処理を施さずに標準的な細胞培養プレートを用いること、という3つの課題に取り組んでいます。細胞が生成した力の変化を病状の予後マーカーとしてどのように使用できるか、そしてこれらの力はその病状に寄与しているのか、それともその病状の二次的な影響なのか?
まず、クエンチャー付きアンカーストランドとフルオロフォア付きリガンドストランドの1.1対1モル比でデュプレックスを組み立てます。溶液中の最終濃度40マイクロモルのリガンド鎖で二本鎖を調製します。組み立てた二本鎖をアニールするために、摂氏98度で5分間インキュベートします。
その後、室温で1時間冷まします。アニーリングステップから最も存在量が少ない鎖(この場合はリガンド鎖)の濃度を使用して、アニーリングされた二本鎖をHUHと反応させます。デュプレックスとHUHを1〜2モル比で混合し、最終濃度は10マイクロモルのデュプレックスと20マイクロモルのHUHです。
反応を摂氏37度で30分間、サーマルサイクラーまたは光保護ヒートブロックでインキュベートします。インキュベーション後、反応を熱から下ろし、卓上型ミニ遠心分離機を使用して、組み立てられたテンションゲージテザー(TGT)をスピンダウンします。TGTが十分に付着したら、PBSで目的の細胞でウェルを3回洗浄します。
これに続いて、無血清培地を使用して2回の洗浄を行い、最終洗浄後に培地をウェルに残します。200マイクロリットルのPBSを周辺ウェルに追加して、エッジの影響を軽減します。プレートを摂氏37度のインキュベーターに移し、プレートを予温します。
次に、目的の細胞を約80%のコンフルエンシーで回収します。培地を吸引し、次にPBSで細胞を洗浄し、細胞が解離するまで摂氏37度のトリプシンで細胞をインキュベートします(これには約5〜10分かかります)。細胞が解離したら、細胞の維持に使用した完全な細胞培地の元の容量を追加します。
血清学的ピペットを使用して細胞を再懸濁し、細胞懸濁液を15ミリリットルの円錐管に移します。細胞を300 Gで4分間遠心分離します。メディアを吸引し、ペレットをPBSに再懸濁します。
遠心分離を繰り返した後、細胞を5ミリリットルの無血清培地に再懸濁し、再度遠心分離します。細胞を吸引し、約2ミリリットルの無血清培地に再懸濁します。再懸濁した細胞の密度を決定し、必要に応じて濃度を調整します。
必要に応じて、薬物効果をテストする場合は、適切な濃度の薬物を細胞に加え、細胞をインキュベーターに戻してインキュベーション前の時間を確保します。次に、インキュベーターから元のプレートを取り出し、実験ウェルの洗浄液から残った残留媒体を取り除きます。ウェルを所望の培地で一度洗浄し、再懸濁した細胞の100マイクロリットルを所望のウェルにピペットで移します。
播種した細胞をインキュベーターに90分間移します。インキュベーション後、各ウェルから約125〜170マイクロリットルの容量を取り出します。必要に応じて、温めたPBSの200マイクロリットルで細胞をやさしく洗います。
次に、各ウェル内の細胞を50マイクロリットルのトリプシンとインキュベートし、細胞が解離し始めるまで(これには約5〜10分かかります)。次に、調製したばかりの160マイクロリットルのフローバッファーを各ウェルに加えます。ピペットで静かに上下に動かして、細胞を解離します。
この細胞懸濁液の196マイクロリットルをPCRチューブに移し、4マイクロリットルのヨウ化プロピジウムを加え、穏やかに混合します。最後に、チューブを氷のバケツに入れ、蓋をして光を遮断し、フローサイトメーターを使用して蛍光強度を測定します。フローサイトメトリーゲーティングにより、生シングルセルの単離が成功し、正確なメカノタイプ解析が保証されました。
Cy5-A蛍光の99パーセンタイルに設定されたネガティブコントロールゲーティングは、実験条件の比較のためのベースラインを提供しました。Y27632で処理したCHO-K1細胞は、剪断TGTでネガティブコントロールゲートを超える細胞の割合が有意に減少したが、TGTを解凍した細胞は、わずかに統計的に有意でない減少を示した。TGTを解凍すると、TGTを剪断した場合と比較して、ネガティブコントロールを超える細胞の割合が一貫して高く、必要な力が小さいことが確認されました。
完全なトランスクリプトを表示し、数千本の科学動画にアクセス
概要
この研究は、リガンドを提示する不動化DNA二重鎖を破裂させる細胞の傾向を測定する手法を提示し、相対的な細胞の牽引力を報告します。この手法により、細胞力の生成を高スループットで測定することができ、メカノバイオロジーの分野に貢献します。
研究の主要な構成要素
科学の分野
- メカノバイオロジー
- 細胞力学
- 高スループット測定技術
背景
- 細胞は様々な分子メカニズムを通じて機械的刺激を伝達します。
- 細胞力の理解はT細胞の活性化や幹細胞の分化に関する洞察に不可欠です。
- 不規則な細胞力学に関連する疾患に対処するためのメカノセラピーが開発されています。
- これらの測定には通常、高性能顕微鏡が必要です。
研究の目的
- 細胞力を測定する高スループット手法を開発すること。
- オミクスの文脈におけるメカノバイオロジーの理解を進めること。
- 細胞プロセスにおける機械的力の影響を探ること。
使用した方法
- DNA二重鎖とヘアピンセンサーを用いた細胞外力の測定。
- 遺伝子でエンコードされたセンサーを用いた細胞内測定。
- 破裂した蛍光オリゴのフローサイトメトリー分析。
- 細胞牽引力を評価する高スループット技術。
主な結果
- 細胞力生成の成功的な測定。
- 細胞の機械的履歴への洞察。
- この手法のメカノフェノタイピングへの適用性の実証。
- メカノセラピー開発の進展の可能性。
結論
- この方法は細胞力学を研究する新しいアプローチを提供します。
- 細胞が環境と相互作用する方法の理解を深めます。
- この研究は細胞力学をターゲットとする新しい治療戦略につながる可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
High-throughput flow cytometry measurement of cellular mechanotype using DNA tension probes enables scalable quantification of cell-generated forces, addressing a key bottleneck in mechanobiology-driven drug discovery. This approach supports predictive confidence in target validation and mechanistic de-risking for diseases where cell mechanics are disrupted. Integrating force measurement into early discovery pipelines enhances portfolio triage and risk-adjusted advancement decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative interrogation of cellular force generation as a functional biomarker.
- Supports mechanistic de-risking by distinguishing primary versus secondary effects in disease models.
- Facilitates target validation for mechanotherapeutic strategies by linking force phenotypes to molecular interventions.
Screening & Assay Development
- Provides a high-throughput, flow cytometry-based readout for scalable mechanotype screening.
- Standardizes force measurement across cell types and conditions using DNA tension probes.
- Enables reproducible, quantitative outputs suitable for compound evaluation and assay development.
Translational & Preclinical Research
- Aligns mechanotype measurements with disease-relevant cellular phenotypes for translational biomarker development.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling force-based phenotypic screening.
- Improves predictive value for mechanotherapeutic candidate selection in preclinical models.
Pipeline & Workflow Integration
This method positions cellular force quantification at the intersection of early discovery, lead identification, and preclinical research, enabling mechanotype-based triage and mechanistic insight throughout the pipeline.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on the role of mechanical forces in disease-relevant pathways.
- Screening: Delivers standardized, high-throughput force readouts for compound and genetic perturbation screens.
- Analytics: Provides quantitative, flow cytometry-based measurements for robust statistical comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical phases by linking mechanotype to disease state and therapeutic response.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for force measurement across diverse cell types and experimental systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of mechanotype assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by integrating force phenotyping into early R&D.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of mechanotherapeutic programs based on quantitative force data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry and DNA probe design for assay setup and data interpretation.
- Needs access to standard flow cytometry instrumentation and analytical infrastructure.
- Demands cross-team standardization of gating strategies and negative control thresholds.
- Adaptable to various cell types and experimental conditions with appropriate probe and ligand selection.
- Dependent on robust statistical analysis to distinguish mechanotype shifts across experimental groups.
