陸生両生類の皮膚からの細菌株の単離と同定

この研究は、野生の陸生両生類から皮膚微生物叢を収集し、保管および取り扱い中に微生物の完全性を確保するための効率的なプロトコルを開発することを目的としていました。

主な課題には、サンプル汚染の防止、保管中の微生物の生存率の維持、両生類の皮膚微生物叢の多様性を完全に評価するための成長の遅い培養が含まれます。

グリセロール強化生理食塩水は、保管および取り扱い中に両生類の皮膚微生物叢の完全性を維持し、一貫した細菌培養を行い、生態学的およびバイオテクノロジー研究のための微生物保全戦略を改善することが確立されました。

このプロトコルは、標準化されたサンプリング方法の欠如に対処し、培養可能な両生類の皮膚細菌を保存および処理し、コミュニティの完全性を確保します。

[ナレーター]まず、摂氏121〜134度で15〜30分間オートクレーブ滅菌して培地を滅菌します。オートクレーブ滅菌後、寒天培地を摂氏約45〜50度まで冷却します。事前に滅菌した層流フードの下で、冷却した培地を滅菌ペトリ皿に注ぎます。寒天が固まったら、ペトリ皿に培地の種類と準備日をラベル付けします。チューブを絞りながら綿棒をチューブ壁に押し付け、綿棒を時計回りに10回、反時計回りに10回完全に回転させて、現場から得られたサンプルを溶液と混合します。処理する前に微生物サンプルを完全に混合します。10 から -1 の累乗から 10 の累乗から -6 の累乗の範囲の生理食塩水で皮膚サンプルの段階希釈を調製します。100マイクロリットルの原液サンプルを接種し、調製した寒天プレートに連続希釈します。滅菌L字型ループを使用して、寒天培地の表面にサンプルを縞模様にし、過度の圧力を加えることなく均一な分布を確保します。接種したプレートを反転させ、摂氏20〜25度に設定したインキュベーター内に3〜5日間置いて、両生類の皮膚上の中温性および向精神性細菌の増殖をサポートします。インキュベーション後、さらなる分析のために、異なる形態を持つ細菌コロニーを選択します。コロニーが十分に分離され、色、サイズ、形状、エッジ、表面、質感の変化など、さまざまな外観を示すことを確認します。選択したコロニーを継代培養するには、無菌条件下で接種ループを使用して、十分に単離されたコロニーを元の寒天プレートから新鮮な寒天プレートに移します。コロニーをストリークして隔離します。そして、適切にインキュベートします。現場設定で滅菌ツールを使用した speleomantes italicus 個体の調整されたサンプリング手順をここに示します。サンプリングは、両生類へのストレスを最小限に抑え、取り扱い中の精度を確保するために、滅菌手袋と綿棒を使用して 2 人のオペレーターによって実行されました。綿棒は、実験室への輸送中に微生物の完全性を維持するために、すぐに 20% グリセロールを含む生理食塩水に移されました。グリセロール添加の有無にかかわらず生理食塩水に保持された微生物群集密度の比較をここに示します。グリセロールを使用しない生理食塩水貯蔵における細菌量は、グリセロールを含む対照および生理食塩水よりも有意に低かった。グリセロールを含む生理食塩水に貯蔵された微生物群集は、対照と同様の細菌量を示し、微生物の完全性が維持されていることを示しています。微生物群集の最良の保存は、グリセロールを摂氏4度で保存した生理食塩水中で観察され、時間の経過とともに最も安定した細菌負荷を示しました。室温で生理食塩水のみで保管すると、細菌の増殖が最も高くなり、微生物汚染または特定の細菌群の選択的促進が示されました。摂氏マイナス20度で凍結すると細菌の負荷が減少し、低温が微生物の生存に悪影響を与えることが示唆されました。