反復漂白法を用いた担腫瘍組織の三次元イメージングは、マルチプレキシック性アプローチを拡張します

この研究は、免疫調節薬および複雑な固形消化管腫瘍の標的を特定することに焦点を当てています。腫瘍微小環境の細胞ランドスケープを分析することは、免疫療法などの治療に対する感受性を理解するために絶対に重要です。シングルセルシーケンシングとフローサイトメトリーは、腫瘍微小環境の特徴付けに役立ちますが、空間的コンテキストが不足しています。最近、生体内の文脈で腫瘍微小環境を研究するためのマルチプレックス イメージングおよびトランスクリプトーム プラットフォームが登場しました。

腫瘍微小環境を分析するために利用可能なマルチプレックステクノロジーは、反復的かオールインワンかにかかわらず、2次元に制限されています。このプロトコルは特性評価を深さの次元に拡張し、単一のFFPEまたは凍結切片を超えた洞察を提供します。

[ナレーター]まず、ティッシュシートを温かい収穫培地の入ったサンプルカップに移し、調製テーブルの加熱プレートに置きます。収穫培地を含む15センチメートルのプレートのプラットフォームに組織をマウントします。中皮側をプラットフォームの小さなオリフィス側の上に上に向けて腫瘍を担う組織を慎重にドレープし、2-0シルク縫合糸で固定します。準備した組織プラットフォームを、収穫培地を含む24ウェルプレートに逆に完全に浸します。固定のために、30ミリリットルのコールドPBSを含む50ミリリットルのコニカルチューブに10ミリリットルの固定ストックを加えて、40ミリリットルの固定バッファーを調製します。鉗子を使用して、プラットフォームに取り付けられた組織を固定バッファーに移します。そして摂氏4度で24時間インキュベートします。固定剤をデカントします。40ミリリットルの冷たいPBSと交換します。そして摂氏4度で10分間インキュベートします。染色するには、1ミリリットルのブロッキングバッファーをウェルに加え、組織プラットフォームを挿入します。室温で30RPMの低速に設定されたロッカーで少なくとも2時間ブロックします。微量遠心チューブに0.8ミリリットルの抗体色素溶液を調製し、室温で10,000gで2分間遠心分離します。0.75ミリリットルの上清を9ウェルインキュベーションプレートのクリーンウェルに移します。そして、洗浄されたプラットフォームを挿入します。プレートをアルミホイルで包みます。そして、30 RPMの低速に設定されたロッカーで室温で少なくとも2時間インキュベートします。40ミリリットルのPBSを含む50ミリリットルの円錐形チューブでプラットフォームを摂氏4度で10分間洗浄します。3.5センチメートルのイメージング皿のガラス底の中央に0.1ミリリットルのPBSを加え、脇に置きます。高さ調整リングを時計回りに外蓋に緩くねじ込みます。また、プラットフォームを内側のプラスチックホルダーに取り付け、ノッチ溝の位置合わせを確保します。スライダーでプラットフォームを固定します。組み立てたイメージングアダプターをガラス底皿に置き、組織がバッファーに触れるまで高さ調整リングを慎重に下げます。ガラスからの最適な距離に達したら、0.2ミリリットルのPBSを底面を上にして組織に加え、イメージング中の組織の脱水を防ぎます。画像取得ソフトウェアを起動します。20Xや40Xなどの適切な対物レンズを選択し、対応する浸漬媒体を追加します。600ヘルツのスキャン速度、1024 x 1024ピクセルのXY解像度、3行平均、双方向スキャンなどの画像取得パラメータを選択します。適切なレーザーラインを選択するか、染色に使用される蛍光色素の励起スペクトルと発光スペクトルに合わせて白色光レーザーを調整します。組み立てたイメージングディッシュを顕微鏡ステージのサンプルホルダーに入れます。XYコントロールを使用して試料を中央に配置し、対物レンズをカバーガラスに近づけて、画像取得を開始します。各イメージングラウンドの後、漂白ステップを実行します。蒸留水中に1.5ミリリットルあたり1.5ミリグラムの水素化ホウ素リチウム溶液5ミリリットルを調製し、室温で30分間インキュベートします。1ミリリットルの水素化ホウ素リチウム溶液を9ウェルインキュベーションプレートのクリーンウェルに移し、洗浄したプラットフォームを室温で60分間挿入します。円錐形のチューブ内の20ミリリットルのPBSでプラットフォームを短時間洗浄します。Z補正の最高レーザー設定を使用して、残りの蛍光信号を確認します。最初のラウンドの反復漂白で染色された腫瘍を担う腹膜サンプルは、視覚化のための多重性拡張、またはIBEX 1パネルをここに示します。腫瘍病変は、乳頭状中皮腫に特徴的な核配置を伴うCD44およびポドプラニンの二重陽性であるロゼット様構造として同定されました。腫瘍を有する腹膜サンプルから選択された領域の高解像度免疫蛍光画像をここに示します。 これらの画像は、腫瘍領域と腫瘍の三次リンパ構造界面を明らかにし、高密度のCD45陽性細胞による一貫した免疫細胞浸潤を強調しています。この図は、IBEXサイクル1〜6にわたる反復免疫蛍光染色を示し、腫瘍病変および腫瘍の三次リンパ構造界面内の免疫マーカーおよび構造マーカーの空間分布を示しています。ここでは、さまざまな光学セクションの最大投影を示します。この 3D イメージングにより、腫瘍病変と三次リンパ構造が異なる Z 深さに存在することが確認され、複雑な組織構造をキャプチャする際の 2D イメージングの限界が実証されました。