高効率プラスミド構築のための In vivo アセンブリの利用

私の博士課程の研究は、バクテリアが分泌するタンパク質の研究に焦点を当てています。私は特に、これらの分泌されたタンパク質の一部がヒトの感染を引き起こすために重要であるかどうかを理解したいと考えています。最近分離された臨床細菌を扱う際の大きな課題は、その抗生物質耐性であり、遺伝子の欠失や遺伝的補完など、抗生物質の選択に依存する分子遺伝学的手法を妨げています。

このクローニングプロトコルは、IVAにより、大腸菌形質転換前のプラスミドアセンブリのための特殊な酵素や逐次酵素反応が不要になるため、より迅速で費用対効果が高くなります。まず、コンピューターシステム上で専用のDNA分析ソフトウェアを起動します。目的のプラスミドを人工的に組み立てます。

次に、各DNAフラグメントに結合するプライマーを設計します。市販のキットを使用して単離したDNAを、PCRチューブ内の相同DNAを含むプライマーと組み合わせます。次に、PCRランでDNAを増幅します。

PCR反応が完了したら、2マイクロリットルの分注液をピペットで取り出します。ローディング染料と組み合わせます。1%アガロースゲル上でアガロースゲル電気泳動を行い、DNA断片を分離します。

次に、紫外線またはLEDトランスイルミネーターを使用してフラグメントを視覚化します。次に、1マイクロリットルのDpnIをPCR反応チューブに直接追加して、メチル化テンプレートDNAを除去します。反応を摂氏37度で15分間または一晩インキュベートします。

核酸精製キットを使用すると、残留酵素、塩、プライマーダイマー、および低分子量DNA製品が除去されます。精製したフラグメントのDNA濃度を分光測光法を用いて定量します。純粋な増幅プラスミドDNAを取得します。

各in vivoアセンブリ反応に必要なプラスミドとインサートDNAの量を計算します。次に、計算された量のプラスミドを組み合わせ、事前に冷却した1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブにDNAを挿入します。チューブを氷の上に置きます。

次に、解凍したrecA-化学的に有能な大腸菌の25〜100マイクロリットルをチューブにピペットで移します。DNA混合物をアリコートに移します。ヒートショック形質転換を行うには、まず大腸菌とDNAの混合物を氷上で30分間インキュベートします。

チューブを摂氏42度のウォーターバスに1分間移します。その後、氷の上に2分間戻します。LBメディアを無菌的にチューブに移し、容量を1ミリリットルにします。

1ミリリットルの混合物をガラス製培養チューブに移します。次に、プラスミドにコードされた抗生物質選択マーカーの回収と産生のために、振とうのあるインキュベーターに入れます。回収後、約100〜1, 000マイクロリットルの変換反応を固体選択媒体に堆積させます。

滅菌セルスプレッダーを使用して、オーガー培養プレート全体にアリコートを分散させます。残りの形質転換細胞を13, 000 Gで1分間遠心分離します。次に、上清を捨て、細胞ペレットを100マイクロリットルの滅菌培地に再懸濁します。

前述したように、再懸濁した細胞を固体選択培地に沈着させます。次に、培養プレートを反転させます。それらを摂氏37度のインキュベーターに一晩置きます。

形質転換された大腸菌培養物を含む培養プレートをインキュベーターから取り出します。コロニーを直接数えて列挙します。適切な抗生物質を添加した無菌増殖培地を無菌培養チューブに移します。

滅菌トランスファーループにより、コロニーをピックアップし、細胞を培養培地に接種します。培養チューブを振とうのあるインキュベーターでインキュベートします。翌日、市販のプラスミド単離キットを使用して、細菌培養物からプラスミドDNAを単離します。

プラスミドが正しく組み立てられているかどうかを判断するには、スペクトロ測光を使用してDNAの濃度を定量化します。50〜150ナノグラムのプラスミドDNAをピペットで取り出し、診断用制限消化反応を行います。プラスミドDNA上の予想される切断部位に基づいて選択された制限酵素を添加します。

制限反応が完了したら、ローディング色素をチューブに加えます。混合物全体を1%アガロースゲルにロードし、電気泳動を行います。実行後、UVまたはLEDトランスイルミネーターでDNA断片を視覚化し、後者と比較します。

単離された2つのプラスミドクローンの酵素消化により、プラスミドクローン1の1つのDNA産物は2.3キロベースペアとなり、これがPSU 19のみであることを示しています。プラスミドクローン2の単回切断により、単一の3キロ塩基対のDNA産物が得られ、二重切断後には2.3キロ塩基対と770キロ塩基対の2つのDNA産物が得られました。