マルチカラーフローサイトメトリーによる血小板サブポピュレーションの解析

私たちの研究では、マルチカラーフローサイトメトリーを使用して血小板亜集団を同定および特徴付け、血栓症、炎症、および疾患特異的状況における役割、活性化パターン、および臨床的関連性を理解することを目的としています。確立されたマルチカラーフローサイトメトリーアッセイは、血小板アゴニストが明確な活性化パターンを誘導し、コラーゲン関連ペプチドと比較して、凝固促進剤および亜集団を生成することを観察することができます。マルチカラーアッセイにより、単一チューブ内の単離されたヒト血小板集団内の単一血小板の血小板活性化、接着、凝集、およびアポトーシス能を同時に測定できます。

[講師]まず、手順に必要なすべての試薬を準備します。次に、10 ミリリットルの 10x Tyrode バッファーと 90 ミリリットルの蒸留水を混合します。0.1グラムのブドウ糖を加え、ヘペスで全容量のpHを7.4に調整します。まず、緩衝液10ミリリットルのpHを7.4に設定し、次に残りの90ミリリットルのpHを通常の塩酸1つで6.5に調整します。血液サンプルの採取には、ドナーごとに 10 ミリリットルの注射器に 2 ミリリットルの ACD 抗凝固剤を準備します。シリンジを室温で平衡させます。予熱したACD注射器でドナーの血液を採取した後、ACD処理された血液を15ミリリットルの反応チューブにゆっくりと移します。ACD処理した血液を209Gで室温で20分間遠心分離し、休憩を使用せずに。その間、50ミリリットルの反応チューブに25ミリリットルのTyrodeのHepes緩衝液、pH 6.5を調製します。遠心分離後、上部の多血小板血漿層をTyrodeのHepesバッファーを含むチューブに穏やかに移します。汚染を防ぐために、バフィーコートと赤血球層の上に約1ミリリットルの多血小板血漿を残します。次に、懸濁液を室温で430Gで10分間遠心分離して、血小板をペレット化します。上清を廃棄し、血小板ペレットをpH 7.4に調整した200〜300マイクロリットルのTyrodeバッファーに慎重に再懸濁します。pH 7.4のTyrodeのHepesバッファーを使用してマイクロリットルあたり200,000血小板に調整する前に、セルカウンターを使用して血小板数を測定します。CD61、CD42B、CD41、CXCR7、CXCR4など、染色前に活性化を必要としない受容体については、抗体ごとに1つの未染色サンプルと1つの染色サンプルを調製します。PAC-1、CD63、CD62P、NXN5、ゾンビNIRなどの活性化を必要とする受容体またはマーカー用。1ミリリットルあたり10マイクログラムのCRPXLでサンプルを活性化し、活性化されたサンプルと非活性化されたサンプルの両方を調製します。血小板を活性化するには、1ミリリットルあたり10マイクログラムのCRPXLで30分間インキュベートします。次に、単離した血小板をさまざまな濃度の蛍光色素結合抗体でインキュベートするか、30分間死滅させます。次に、各サンプルに300マイクロリットルのアネキシン結合バッファーを加えて希釈します。フローサイトメーターを使用して、各サンプルの10,000イベントを測定します。各抗体の染色指数を計算して、陽性集団と陰性集団の間の最適な分離を決定します。染色指数を抗体濃度に対してプロットして、各抗体の最適な濃度を特定します。染色するには、ヘメン粉末を1.4M水酸化ナトリウムに溶解して3M溶液を作成します。溶液を摂氏96度に毎分450回転で5分間加熱します。蒸留水で希釈して、3ミリモルの茎溶液を得る。血小板数をサンプルあたり100万血小板に調整した後、前述のように血小板を活性化します。各サンプルに43.3マイクロリットルの抗体カクテルを加え、暗所で室温で30分間インキュベートします。インキュベーション後、各サンプルを 300 マイクロリットルの 1 X と X で 10 ミリモルの Hepes 水酸化ナトリウムで構成される結合バッファーで pH 7.4 で希釈します。フローサイトメーターを使用して、染色された各サンプルをすぐに測定します。ビーズで代償するには、蛍光色素ごとに150マイクロリットルのPBSを調製し、ビーズ1滴と蛍光結合抗体1マイクロリットルを加えます。アネキシンVを補償するには、アネキシンVと同じ蛍光色素に結合した抗ヒトCD 62Lで標識されたPECY7B7ビーズを使用します。150マイクロリットルのPBSに2滴のポジティブビーズと1滴のネガティブビーズを1マイクロリットルのダイと混合することにより、アミン反応性色素にアミン反応性補償ビーズを使用します。ポジティブビーズが反応してシグナルを表示し、ネガティブビーズが反応しないことを確認します。すべてのマーカーに対して蛍光から1つのコントロールを引いたものを準備します。散布図は、血小板集団の明確な変化を示しました。 ヘミンは、他のアゴニストよりも前方散乱が少ない血小板を形成します。ADPトロンビンとCRPXLによる治療により、CD42陽性の血小板が40〜60%となり、ヘミンはこの集団を大幅に減少させました。すべての血小板アゴニストは、CD41およびCD61表面発現に影響を与えませんでした。ヘメンのみがCXCR4およびCXCR7表面発現を有意に増加させました。さらに、ホスファチジルセリン曝露もヘミン処理下で増強され、アネキシンV陽性細胞が増強されました。UMAP およびフェノール グラフ分析により、アゴニストの種類によって異なる 27 の異なる血小板クラスターが定義されました。ヘミンはクラスターパターンに最も劇的な変化を引き起こしました。安静時の血小板亜集団は、ADPで最も保存され、ヘミンでリースされました。