Name: マルチカラーフローサイトメトリーによる血小板サブポピュレーションの解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: 学ぶマルチカラーフローサイトメトリーによる血小板サブポピュレーションの解析手法。UMAPとPhenoGraphを用いて27のクラスターを同定し、ヘミンやADPなどの刺激薬による活性化パターンの違いを明らかにする。血栓症や炎症における血小板機能の理解に貢献する。

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<ol><li>Freedman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+regulation+of+platelet-dependent+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Molecular regulation of platelet-dependent thrombosis.</a> Circulation. 112 (17), 2725-2734 (2005).</li>
<li>Koupenova, M., Kehrel, B. E., Corkrey, H. A., Freedman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombosis+and+platelets%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Heart+J%22%5BJournal%5D)">Thrombosis and platelets: an update.</a> Eur Heart J. 38 (11), 785-791 (2016).</li>
<li>van der Meijden, P. E. J., Heemskerk, J. W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+biology+and+functions%3A+new+concepts+and+clinical+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Platelet biology and functions: new concepts and clinical perspectives.</a> Nat Rev Cardiol. 16 (3), 166-179 (2019).</li>
<li>Li, Z., Delaney, M. K., O'Brien, K. A., Du, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+During+Platelet+Adhesion+and+Activation%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscl+Thrombosis+Vas+Biol%22%5BJournal%5D)">Signaling During Platelet Adhesion and Activation.</a> Arterioscl Thrombosis Vas Biol. 30 (12), 2341-2349 (2010).</li>
<li>Oishi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heme+activates+platelets+and+exacerbates+rhabdomyolysis-induced+acute+kidney+injury+via+CLEC-2+and+GPVI%2FFcRgamma%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Adv%22%5BJournal%5D)">Heme activates platelets and exacerbates rhabdomyolysis-induced acute kidney injury via CLEC-2 and GPVI/FcRgamma.</a> Blood Adv. 5 (7), 2017-2026 (2021).</li>
<li>Bourne, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heme+induces+human+and+mouse+platelet+activation+through+C-type-lectin-like+receptor-2%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Heme induces human and mouse platelet activation through C-type-lectin-like receptor-2.</a> Haematologica. 106 (2), 626-629 (2021).</li>
<li>Rohlfing, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cGMP+modulates+hemin-mediated+platelet+death%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Res%22%5BJournal%5D)">cGMP modulates hemin-mediated platelet death.</a> Thromb Res. 234, 63-74 (2024).</li>
<li>Chu, Y., Guo, H., Zhang, Y., Qiao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procoagulant+platelets%3A+Generation%2C+characteristics%2C+and+therapeutic+target%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Lab+Anal%22%5BJournal%5D)">Procoagulant platelets: Generation, characteristics, and therapeutic target.</a> J Clin Lab Anal. 35 (5), e23750(2021).</li>
<li>Sodergren, A. L., Ramstrom, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+subpopulations+remain+despite+strong+dual+agonist+stimulation+and+can+be+characterised+using+a+novel+six-colour+flow+cytometry+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Platelet subpopulations remain despite strong dual agonist stimulation and can be characterised using a novel six-colour flow cytometry protocol.</a> Sci Rep. 8 (1), 1441(2018).</li>
<li>Agbani, E. O., Poole, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procoagulant+platelets%3A+generation%2C+function%2C+and+therapeutic+targeting+in+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Procoagulant platelets: generation, function, and therapeutic targeting in thrombosis.</a> Blood. 130 (20), 2171-2179 (2017).</li>
<li>Agbani, E. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+Membrane+Ballooning+and+Procoagulant+Spreading+in+Human+Platelets%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Coordinated Membrane Ballooning and Procoagulant Spreading in Human Platelets.</a> Circulation. 132 (15), 1414-1424 (2015).</li>
<li>Heemskerk, J. W., Mattheij, N. J., Cosemans, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet-based+coagulation%3A+different+populations%2C+different+functions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Platelet-based coagulation: different populations, different functions.</a> J Thromb Haemost. 11 (1), 2-16 (2013).</li>
<li>Rukoyatkina, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifaceted+effects+of+arachidonic+acid+and+interaction+with+cyclic+nucleotides+in+human+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Res%22%5BJournal%5D)">Multifaceted effects of arachidonic acid and interaction with cyclic nucleotides in human platelets.</a> Thromb Res. 171, 22-30 (2018).</li>
<li>Taylor, M. L., Misso, N. L. A., Stewart, G. A., Thompson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Expression+of+Platelet+Activation+Markers+CD62P+and+CD63+Following+Stimulation+with+PAF%2C+Arachidonic+Acid+and+Collagen%5BTitle%5D)+AND+%22Platelets%22%5BJournal%5D)">Differential Expression of Platelet Activation Markers CD62P and CD63 Following Stimulation with PAF, Arachidonic Acid and Collagen.</a> Platelets. 6 (6), 394-401 (1995).</li>
<li>van Velzen, J. F., Laros-van Gorkom, B. A., Pop, G. A., van Heerde, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+flow+cytometry+for+evaluation+of+platelet+surface+antigens+and+activation+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Res%22%5BJournal%5D)">Multicolor flow cytometry for evaluation of platelet surface antigens and activation markers.</a> Thromb Res. 130 (1), 92-98 (2012).</li>
<li>Hindle, M. S., Spurgeon, B. E. J., Cheah, L. T., Webb, B. A., Naseem, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multidimensional+flow+cytometry+reveals+novel+platelet+subpopulations+in+response+to+prostacyclin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Multidimensional flow cytometry reveals novel platelet subpopulations in response to prostacyclin.</a> J Thromb Haemost. 19 (7), 1800-1812 (2021).</li>
<li>Johnson, L., Lei, P., Waters, L., Padula, M. P., Marks, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+platelet+subpopulations+in+cryopreserved+platelet+components+using+multi-colour+imaging+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Identification of platelet subpopulations in cryopreserved platelet components using multi-colour imaging flow cytometry.</a> Sci Rep. 13 (1), 1221(2023).</li>
<li>Laspa, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemin-induced+platelet+activation+is+regulated+by+the+ACKR3+chemokine+surface+receptor+and+has+implications+for+passivation+of+vulnerable+atherosclerotic+plaques%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Hemin-induced platelet activation is regulated by the ACKR3 chemokine surface receptor and has implications for passivation of vulnerable atherosclerotic plaques.</a> FEBS J. 291 (24), 5420-5434 (2024).</li>
<li>Mueller, K. A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+Migration+Inhibitory+Factor+Promotes+Thromboinflammation+and+Predicts+Fast+Progression+of+Aortic+Stenosis%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Macrophage Migration Inhibitory Factor Promotes Thromboinflammation and Predicts Fast Progression of Aortic Stenosis.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 44 (9), 2118-2135 (2024).</li>
<li>Jourdi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consensus+report+on+flow+cytometry+for+platelet+function+testing+in+thrombocytopenic+patients%3A+communication+from+the+SSC+of+the+ISTH%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Consensus report on flow cytometry for platelet function testing in thrombocytopenic patients: communication from the SSC of the ISTH.</a> J Thromb Haemost. 21 (10), 2941-2952 (2023).</li>
<li>Flores-Montero, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorochrome+choices+for+multi-color+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Meth%22%5BJournal%5D)">Fluorochrome choices for multi-color flow cytometry.</a> J Immunol Meth. 475, 112618(2019).</li>
<li>Clemetson, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+expression+of+CCR1%2C+CCR3%2C+CCR4%2C+and+CXCR4+chemokine+receptors+on+human+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Functional expression of CCR1, CCR3, CCR4, and CXCR4 chemokine receptors on human platelets.</a> Blood. 96 (13), 4046-4054 (2000).</li>
<li>Rohlfing, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ACKR3+regulates+platelet+activation+and+ischemia-reperfusion+tissue+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">ACKR3 regulates platelet activation and ischemia-reperfusion tissue injury.</a> Nat Commun. 13 (1), 1823(2022).</li>
<li>Rath, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+stromal+cell-derived+factor-1+receptors+CXCR4+and+CXCR7+on+circulating+platelets+of+patients+with+acute+coronary+syndrome+and+association+with+left+ventricular+functional+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Heart+J%22%5BJournal%5D)">Expression of stromal cell-derived factor-1 receptors CXCR4 and CXCR7 on circulating platelets of patients with acute coronary syndrome and association with left ventricular functional recovery.</a> Eur Heart J. 35 (6), 386-394 (2014).</li>
<li>Hashemzadeh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+review+of+the+ten+main+platelet+receptors+involved+in+platelet+activity+and+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Blood+Res%22%5BJournal%5D)">A comprehensive review of the ten main platelet receptors involved in platelet activity and cardiovascular disease.</a> Am J Blood Res. 13 (6), 168-188 (2023).</li>
<li>Moroi, M., Farndale, R. W., Jung, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation-induced+changes+in+platelet+surface+receptor+expression+and+the+contribution+of+the+large-platelet+subpopulation+to+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Res+Pract+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Activation-induced changes in platelet surface receptor expression and the contribution of the large-platelet subpopulation to activation.</a> Res Pract Thromb Haemost. 4 (2), 285-297 (2020).</li>
<li>Busuttil-Crellin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+panel+design%2C+optimization%2C+and+performance+of+whole+blood+multi-color+flow+cytometry+of+platelet+surface+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Platelets%22%5BJournal%5D)">Guidelines for panel design, optimization, and performance of whole blood multi-color flow cytometry of platelet surface markers.</a> Platelets. 31 (7), 845-852 (2020).</li>
<li>Fink, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Subtilisin-Like+Protease+Furin+Regulates+Hemin-Dependent+Ectodomain+Shedding+of+Glycoprotein+VI%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">The Subtilisin-Like Protease Furin Regulates Hemin-Dependent Ectodomain Shedding of Glycoprotein VI.</a> Thromb Haemost. 123 (7), 679-691 (2023).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>10x 結合バッファー&nbsp;&nbsp;</td><td>Invitrogen, 米国カリフォルニア州カールスバッド</td><td>88-8103-74</td><td>バッファー&nbsp;</td></tr><tr><td>アデノシン二リン酸 (ADP)</td><td>Probe & go Labordiagnostica GmbH Lemgo、ドイツ&nbsp;&nbsp;</td><td>70212</td>血<td>小板作動薬&nbsp;</td></tr><tr><td>アネキシン V PE-シアニン7</td><td>Invitrogen、 米国カリフォルニア州カールスバッド</td><td>88-8103-74</td><td>染料&nbsp;</td></tr><tr><td>抗 CD41 AF 700</td><td>BioLegend、 米国カリフォルニア州サンディエゴ</td><td>303728</td><td>抗体&nbsp;</td></tr><tr><td>抗 CD41 Alexa Fluor 700</td><td>BioLegend、 米国カリフォルニア州サンディエゴ</td><td>303727</td><td>抗体&nbsp;</td></tr><tr><td>抗CD42b PerCP /シアニン5.5&nbsp;</td><td>BioLegend、 米国カリフォルニア州サンディエゴ</td><td>303918</td><td>抗体&nbsp;</td></tr><tr><td>抗 CD61 BV605</td><td>BD Bioscience フランクリン レイクス、ニュージャージー州、米国&nbsp;</td><td>744382</td><td>抗体&nbsp;</td></tr><tr><td>抗 CD62P PE</td><td>Beckman Coulter、 Brea、カリフォルニア州、米国</td><td>IM1759U</td><td>抗体&nbsp;</td></tr><tr><td>抗CD63 PE / Cy5&nbsp;</td><td>Abcam、 カンブリグデ、英国抗体</td><td>234251 抗体</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>抗CXCR4 BV650</td><td>BD Bioscience 米国ニュージャージー州フランクリンレイクス</td><td>740599</td>抗体<td>&nbsp;</td></tr><tr><td>抗CXCR7 BV421&nbsp;</td><td>BD Bioscience 米国ニュージャージー州フランクリン レイクス&nbsp;</td><td>566234</td><td>抗体&nbsp;</td></tr><tr><td>抗 PAC-1 FITC</td><td>BD Bioscience 米国ニュージャージー州フランクリン レイクス</td><td>340507</td><td>抗体&nbsp;</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン (BSA)</td><td>Applichem、 ダルムシュタット、ドイツ</td><td>A1391</td><td>-</td></tr><tr><td>クリン酸&nbsp;</td><td>Carl Roth、 カールスルーエ、ドイツ</td><td>6490.1-CRP-XL</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>CambCol Laboratories、 Ely、英国</td><td>CRP-XL</td><td>血小板アゴニスト&nbsp;</td></tr><tr><td>D-(+)-グルコース</td><td>シグマ アルドリッチ社、 セントルイス、ミズーリ州、米国</td><td>G7528-Dubecco</td><td></td></tr><tr><td>'s リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)</td><td>Sigma Aldrich Co, 米国ミズーリ州セントルイス</td><td>D8537-Hemin</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich Co.、 米国ミズーリ州セントルイス</td><td>H9039-10G</td><td>血小板アゴニスト&nbsp;</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Carl Roth、 カールスルーエ、ドイツ</td><td>9105.3</td><td>-</td></tr><tr><td>塩化カリウム&nbsp;</td><td>Carl Roth、 カールスルーエ、ドイツ</td><td>6781.3</td><td>-</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム&nbsp;</td><td>Carl Roth、 カールスルーエ、ドイツ</td><td>3957.1</td><td>-</td></tr><tr><td>炭酸水素ナトリウム&nbsp;&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich Co, 米国ミズーリ州セントルイス</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>401676-Thrombin&nbsp;</td><td>ロシュ&nbsp;</td><td>10602400001</td>血<td>小板作動薬&nbsp;</td></tr><tr><td>トリ-クエン酸ナトリウム-ジヒドラート&nbsp;</td><td>Applichem、 Darmstadt、ドイツ</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>1416551211-Zombie NIR</td><td>BioLegend、 San Diego, CA, USA</td><td>423105</td><td>アミン反応性色素&nbsp;</td></tr></tbody></table>

マルチカラーフローサイトメトリーによる血小板サブポピュレーションの解析

Analyzing Platelet Subpopulations by Multi-color Flow Cytometry

マルチカラーフローサイトメトリーパネルによって収集された生データの解析には、2つのオプションがあります。1つのオプションは、解析ソフトウェアを使用して手動で解析することです(図3 および 図4)。したがって、生データをソフトウェアウィンドウにドラッグアンドドロップする必要があります。まず、散布図表示モードでSSC/FSCスケールを調整してセルを見つけ、血小板集団を個別の点群として表示する必要があります。次に、各マーカーの陽性細胞は、ディスプレイをヒストグラムモードにして未処理のピケと処理ピケの間の閾値を設定するか、散布図ディスプレイを使用してFMOによって決定されるゲートを定義することにより、未処理サンプルと処理済みサンプルを使用して定義できます。
血小板集団の明確な変化は、ドットプロットで見ることができます(図4A)。ヘミンは、他の活性剤と比較して、FSCが低い血小板をより多く形成します。ADP、トロン...

Platelets, or thrombocytes, are small anucleated blood cells that play a crucial role in hemostasis and thrombosis. Defects in platelet functions can ...

analyzing-platelet-subpopulations-by-multi-color-flow-cytometry

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

本稿では、大規模な自然免疫と適応白血球集団を列挙するために新鮮な全血で行わ表現型アッセイの染色と分析の手順を紹介します。我々は、多施設臨床試験のコンテキストでこれらの手順を実行する際の考慮事項を強調している。...

全血の表現型アッセイを用いて多施設臨床試験のための主要な末梢血白血球集団の列挙

この研究では、血小板の接着、広がり、および分泌の流れを調べるための蛍光顕微鏡検査に基づく方法を説明しています。この多目的プラットフォームは、血栓症および止血に関する機械的研究のための血小板機能の調査を可能にする。...

流れの下での血小板の脱顆粒および分泌の生きた細胞イメージング

ここでは、CD4 を識別するためにフロー フローサイトメトリーによるプロトコルを提案+および CD8+ T 細胞、γδ T 細胞、B 細胞、NK 細胞、7 つではなく 2 つだけ螢を用いたひと末梢血単球。このアプローチでは、5 つの追加のマーカーはほとんど流れの cytometers...

7 免疫細胞サブセット 2 螢光色素の差別フローサイトメトリー

ここでは、抗凝固剤の存在下でマウス血液を採取した。血小板は、低速遠心分離を用いてイオヘキソール勾配培地によって精製した。血小板は、実行可能であるかどうかを調査するためにトロンビンで活性化された.精製された血小板の質を、フローサイトメトリーおよび顕微鏡検査によって分析した。...

マウスの血液からの血小板の浄化

このプロトコルは、ロイコフィルター由来CD34+造血前駆物質の取得に関与するすべてのステップと、培養培地中の血小板を放出することができる原血小板を持つ巨核球への それらの体外...

巨核球分化と血小板形成を研究する細胞源としての白血病の枯渇フィルター由来CD34+細胞

ここでは、細胞分裂の数、表面細胞の表現型、および細胞の親族関係を同時に測定できるフローサイトメトリーベースの技術を紹介します。これらのプロパティは、順列ベースのフレームワークを使用して統計的にテストできます。...

フローサイトメトリー による 造血幹細胞と前駆細胞の血縁関係、分裂数、表現型の同時評価

凝固促進剤の血小板形成は、血栓症のリスク増加と相関しています。.ここに提示されるのは、ヒトの血液から洗浄された血小板を単離するための正確なプロトコルであり、凝固促進剤の血小板の特徴であるホスファチジルセリンおよび微小胞放出の曝露を定量化することを目的としています。...

ヒト精製血小板からのホスファチジルセリン曝露と微小胞放出の測定による凝固促進血小板の特性評価

本記事では、全血型サイトメトリーを用いて組織因子(TF)陽性血小板の割合を定量化するプロトコルを概説し、タンパク質の評価を行います。(1) 安静状態における細胞内、(2)...

ヒト血小板における組織因子発現のフローサイトメトリー解析

本プロトコルは、壊死、アポトーシス、および血小板活性化の重複する特徴を示す凝固促進血小板を分析するために必要な包括的な一連の手順を提供します。...

壊死、アポトーシス、血小板活性化の特徴を示す凝固促進血小板の包括的解析

この記事では、安定同位体追跡、特定の細胞タイプを分離するための細胞選別、および質量分析の組み合わせを使用して、複数の細胞タイプの複雑なコミュニティにおける細胞代謝を研究する方法について説明します。...

安定同位体のトレースを使用した複雑な細胞のコミュニティのソートされた亜集団で代謝を測定する方法

学ぶマルチカラーフローサイトメトリーによる血小板サブポピュレーションの解析手法。UMAPとPhenoGraphを用いて27のクラスターを同定し、ヘミンやADPなどの刺激薬による活性化パターンの違いを明らかにする。血栓症や炎症における血小板機能の理解に貢献する。

マルチカラーフローサイトメトリーによる血小板サブポピュレーションの解析

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