Name: Drosophila melanogasterにおける遺伝子座特異的リボソームRNA転写の一塩基多型感受性FISH検出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-28T14:50:00.000+00:00
Duration: 4 min 59 s
Description: 学ぶSNP-FISH法によるDrosophila melanogasterのリボソームDNA遺伝子座特異的転写検出。蛍光顕微鏡でXとY染色体のrRNA転写を区別し、細胞がrDNA量に応じて転写を調節するメカニズムを解明する。

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</ol>

<table><tbody><tr><td>PTC Tempo 96 サーマルサイクラー</td><td>バイオ・ラッド</td><td>12015382</td><td>任意のサーマルサイクラーを使用可能</td></tr><tr><td>0.2 mL 8 ストリップフラットキャップ PCR チューブ</td><td>VWR</td><td>89133-912</td> 任意の<td>互換チューブを使用可能</td></tr><tr><td>1 kb DNA ラダー</td><td>NEB</td><td>N3232S</td><td>ゲル電気泳動によるシーケンシング PCR アンプリコンサイズをチェックする際に使用</td></tr><tr><td>1.5 mL 目盛り付き微量遠心チューブ</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5510</td><td>認定されたRNaseフリーチューブは、</td></tr><tr><td>2 mM dNTPミックス</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R0241</td><td></td></tr><tr><td>50x TAE Buffer</td><td>Bio Rad</td><td>1610743</td><td>ゲル電気泳動に使用されます。任意のTAEバッファを使用できます。</td></tr><tr><td>5M NaCl</td><td></td><td></td><td>任意のNaClは、任意のソースから使用または調製することができます</td></tr><tr><td>アガロース</td><td>VWR</td><td>97064-250</td><td>任意のアガロースは、ApE</td></tr><tr><td>-プラスミドエディタソフトウェア</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr> <tr><td>https://jorgensen.biology.utah.edu/wayned/ape/ クリアマニキュア</td><td></td><td></td><td>任意の小売業者からの任意のマニキュアを使用することができます</td></tr><tr><td>カバーガラス、No.1 厚さ</td><td>トーマスサイエンティフィック</td><td>6672A38</td><td></td></tr><tr><td>脱イオンホルムアミド</td><td>フィッシャー サイエンティフィック サイエンティフィ</td>ック <td>NC9569627</td><td></td></tr><tr><td>デキストラン硫酸ナトリウム</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>D8906-10G</td><td></td></tr><tr><td>ドリームタック グリーン PCR マスターミックス</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>K1081</td><td></td></tr><tr><td>デュモン #5 鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11252-20</td><td>サンプルの解剖に使用</td></tr><tr><td>EDTA (0.5M)、Ph 8.0</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>R1021</td><td>同等の製品であれば何でも使用可能</td></tr><tr><td>エタノール</td><td>VWR</td><td>89125-172</td><td>200プルーフのエタノールであれば何でも使用できます。Rnaseフリー条件の透過化および洗浄のための70%エタノールへの希釈に使用</td></tr><tr><td>臭化エチジウム</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15585011</td><td></td></tr><tr><td>水平ミニゲル電気泳動システム</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-955-170</td><td>任意のゲル電気泳動システムを使用することができます</td></tr><tr><td>キムワイプス</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>06-666</td><td></td></tr><tr><td>マイクロテスト染色 ディッシュ</td><td>エレクトロン顕微鏡科学</td><td>71564</td><td>サンプルの解剖に使用</td></tr><tr><td>ニューティングシェーカー</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>BMSB3D1020</td><td>どんなニューティングシェーカーでも使用可能</td></tr><tr><td>パラフィルム</td><td>USA サイエンティフィック</td><td>3023-4526</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (10倍) pH 7.4, RNaseフリー</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ <td>AM9624</td><td></td></tr><tr><td>ピアス 16% ホルムアルデヒド (w/v), メタノールフリー</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ<td>28908</td><td></td></tr><tr><td>精密汎用ウォーターバス</td><td>ライフテクノロジー</td><td>TSGP02</td><td>任意のウォーターバスを使用可能</td></tr><tr><td>QIAquickゲル抽出キット</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>任意のゲル抽出キットを使用可能</td></tr><tr><td>組換えプロテイナーゼK溶液(20 mg/mL)</td><td>Invitrogen</td><td>AM2546</td><td>同等の製品を使用可能</td></tr><tr><td>RnaseフリーのUltraPure BSA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM2618</td><td></td></tr><tr><td>S. cerevisiae tRNA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R8759</td><td></td></tr><tr><td>SSC (20X), RNase-free</td><td>Fisher Scientific</td><td>AM9763</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Life Technologies</td><td>A16046.AE</td><td></td></tr><tr><td>UltaPure 1M Tris-HCl Buffer, pH 7.5</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15567027</td><td>同等の製品であれば何でも使用可能</td></tr><tr><td>UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water</td><td>Life Technologies</td><td>10977023</td><td></td></tr><tr><td>Vanadyl ribonucleoside complex</td><td>NEB</td><td>S1402S</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD 封入剤と DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200-10</td><td></td></tr><tr><td>VWR Superfrost Microscope Slide</td><td>VWR</td><td>48311-601</td><td></td></tr><tr><td>y[1]w[1] Drosophila melanogaster line</td><td>ブルーミントン ショウジョウバエ ストックセンター</td><td>1495</td><td></td></tr><tr><td>ツァイス LSM 980 共焦点顕微鏡</td><td>ツァイス顕微鏡</td><td></td><td>発光と検出が相性の良い共焦点顕微鏡を使用可能</td></tr><tr><td>ツァイスステミ 2000-C 実体顕微鏡と光源</td><td>顕微鏡 セントラル</td><td>455053</td><td>どんなステロ顕微鏡でも使用可能</td></tr></tbody></table>

drosophila melanogasterにおける遺伝子座特異的リボソームrna転写の一塩基多型感受性fish検出

Single Nucleotide Polymorphism-sensitive FISH Detection of Locus-specific Ribosomal RNA Transcription in Drosophila melanogaster

SNPジェノタイピングのシーケンシング結果により、X遺伝子座とYrDNA遺伝子座の間のSNPの違いが検出されることが期待されます。これらのSNPは、シーケンシングクロマトグラムのSNP位置を直接評価することで検出されます (図2)。女性サンプルのシーケンシングでは、SNP位置に単一のシーケンシングシグナルがあることが予想され、2つのX染色体間のSNPホモ接合性を示します (図2A)。オスサンプルのシーケンシング結果は、SNP位置にダブルピークを持つことが予想されます (図2B)。女性サンプルのシーケンシングから決定されたX染色体の遺伝子型に基づいて、非XバリアントはY染色体rDNA SNPであると推測されます(つまり、 図2の18S SNPシーケンシングではX = T、Y = C)。あるいは、雄サンプルのSNP位置にある単一のシーケンシングピークは、そのSNP位置における雄と雌のrDNA遺伝子座間のホモ接合性を示し、その位置はrRNA SNP-FISHには使用できません。
SNP FISHのプロトコルに従って、サンプルをスライドにマウントし、密封されたカバースリップの下に置いた後、共焦点顕微鏡で観察することができます。表3に示すプローブを用いて、Y由来のrRNAシグナルをAlexa Fluor 647の発光で検出し、X由来のrRNAシグナルをAlexa Fluor 488の発光で検出します。rRNAシグナルは核小体で観察されることが予想され、核内のDAPI不良穴として特定できます(図3A)。核小体は、その大きな核と核小体のために、生殖細胞で特に同定が容易です(図3A)。微弱なシグナルは通常、細胞質にも見られますが(図3)、これは非特異的なシグナルであり、相補的なSNPを含むrRNAを含まないサンプルでも検出できます(つまり、Y rDNAを欠く細胞のYシグナルまたはX rDNAを欠く細胞のXシグナル;図 3B-C)。さらに、XおよびY rRNAの人工的共標識は、XまたはY rDNA遺伝子座を欠くサンプルであっても、体細胞ハブで検出できることがあります(図3B-C、黄色の矢印)。したがって、核シグナルのみを使用して遺伝子座特異的な転写を評価する必要があります。ほとんどの細胞、特に体細胞は、Y rRNAシグナルのみを有すると予想され、これはrRNAがY rDNA遺伝子座からのみ転写されることを示している(図3A、黄色の点線の円、および赤い矢印)10,17。しかし、XおよびY rRNAの共発現は、生殖細胞、特に生殖幹細胞13で検出されることが多い(図3A、白い点線の円)。共発現細胞のXおよびY rRNAシグナルは、隣接して1つの核小体を形成する場合(図3A上の細胞)または分離して2つの核小体を形成する場合(図3A下の細胞)があります。図 3 の例は、rDNA SNP-FISH から 2 つの SNP(2 つの ITS1 SNP)のみを対象とするプローブセットを使用したもので、rDNA SNP-FISH に必要な SNP は 2 つだけであることを示しています。しかし、4つのSNPすべてを標的とするプローブを使用すると、より頑健なシグナルが観察される13。
ネガティブコントロールは、特にメソッドを最初にトラブルシューティングする際に、プローブが間違ったSNPターゲットと交差反応しないことを確認するために、このアッセイの重要なインクルージョンです。X染色体陰性コントロールには、X染色体rDNAを欠くあらゆる状態、例えば、rDNA欠失を有するX染色体を有する男性が含まれる。X染色体ネガティブコントロールは、Y rRNAシグナルのみを検出し、X rRNAは検出しないことが期待されます (図3B)。Y染色体陰性コントロールには、Y染色体rDNAを欠く任意の状態が含まれます。これらの状態の例としては、XXの女性組織、Y染色体を欠く男性の組織、またはrDNA欠失15を持つY染色体を持つ男性の組織があります。Y染色体ネガティブコントロールは、X rRNAシグナルのみを検出し、検出可能なY rRNAシグナルは検出しないことが期待されます (図3C)。これらのコントロールは、プローブの特異性を判断するためだけでなく、信号の背景やアーチファクトを決定するためにも重要であることに注意してください。このようなコントロールに特異性を提供する新規のプローブまたはアッセイ条件は、遺伝子座特異的なrDNA転写を検出するために正確に使用できます。
遺伝的、発生的、または環境条件が異なると、rDNAがY染色体rDNA遺伝子座13,17から排他的に転写される可能性が変わる可能性がある。単一の遺伝子座または複数の遺伝子座からのrDNA転写の頻度を定量化し、サンプル間で直接比較することができます。rDNA遺伝子座の転写の違いを定量的に比較するためには、各細胞をY-dominant、Co-dominant、またはX-dominantに個別に分類する必要があります。細胞がY優性およびX優性として分類されるのは、それぞれのシグナルのみが検出された場合のみです。YとXの両方のrRNAシグナルを持つ細胞は、一方のシグナルが他方のシグナルよりもはるかに弱い場合でも、共優性と見なされます。したがって、非常に強いXシグナルとYシグナルを含む細胞は、強いYと弱いXシグナルを持つ細胞、または強いXシグナルと弱いYシグナルを持つ細胞と定性的には同じと見なされます。各カテゴリのすべてのサンプルにわたるすべてのセルの合計パーセンテージは、カイ二乗検定によってサンプル間で比較できます。このアッセイは、特定のrDNA遺伝子座が転写されるかどうかを定性的に判断するのには適していますが、個々のSNP-FISHシグナルの蛍光強度を直接定量する場合、サンプル間で一貫した評価は観察されていません。したがって、サンプル間のFISHシグナル強度や、単一細胞内のXおよびY rDNAシグナルの相対強度を定量的に評価することはお勧めしません。この蛍光強度の不一致の原因は不明ですが、すべての標的rRNAに結合しないマスクプローブの非効率的な結合が原因である可能性があります。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67881/67881fig01.jpg"> 
図1:SNP-FISH法の図。 (A)従来のFISHアンチセンスオリゴヌクレオチドプローブは、ヌクレオチドが1つだけ異なる非標的RNAと交差反応します。(B)SNP-FISH法では、オリゴヌクレオチドプローブの3'領域に結合した相補型マスクオリゴヌクレオチドを使用します。マスクは、標的配列に結合するために10ヌクレオチドのみを残します。マスクされていないプローブ領域は、1つ以上のヌクレオチドが異なる非標的配列に安定して結合しません。マスクは、プローブがターゲットに結合した後、プローブから解離するため、プローブとターゲット間の安定した結合が可能になります。(C)共通のマスクと組み合わせた異なる標識ペアのSNPプローブは、交差反応することなく、単一のヌクレオチドで異なるターゲットに特異的に結合します。(D)複数のプローブをプールして、異なるrRNAハプロタイプを特異的に標識することができます。 y1w1 Drosophila melanogaster 株のXとY rDNA遺伝子座の間で4つのSNPの違いが特徴付けられています。18S rRNAに1つのSNP、28S rRNAに1つ、pre-rRNAのITS1部分に2つのSNPがあります。SNP-FISHに用いたXおよびY特異的なrRNAハプロタイプを表示します。4つのrRNA SNPでX rDNAバリアントを標的とするプローブは共通の蛍光色素(緑色)に結合し、Y rDNA変異体を標的とするプローブは異なる蛍光色素(マゼンタ)に結合します。各 SNP に共通のマスクが使用されます (合計 4 つ)。rRNA上の各SNP位置に結合するSNP特異的プローブは、最大4つのFISHオリゴヌクレオチドプローブを使用して、XおよびY rDNA遺伝子座のrRNAを特異的に標識できます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67881/67881fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67881/67881fig02.jpg"> 
図2:ホモ接合型およびヘテロ接合型のrDNA SNPシーケンシング結果の例。 例:(A)女性および(B)男性サンプルからのDNAの18S SNPシーケンシングからのクロマトグラムシーケンシング。18S SNP の位置はアスタリスク (*) で示されます。女性サンプルのSNP位置の単一のチミン(T)信号は、X染色体rDNA遺伝子座のSNP位置にチミンがあることを示しています。男性サンプルのSNP位置での二重シグナルは、Y染色体rDNA遺伝子座のSNP位置にあるシトシンを示しています(チミンがX染色体遺伝子座にあることがわかっていることから推測されます)。シーケンシング結果は、プラスミドエディタソフトウェアであるApEを使用して表示しました19。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67881/67881fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67881/67881fig03.jpg"> 
図3:2つのSNP-FISHプローブセットのみを使用した ショウジョウバエ 精巣でのSNP-FISHの結果の例。 (A)XとY rDNAの両方、(B)Y rDNAのみ、または(C)X rDNAのみを持つ動物の精巣におけるSNP FISHの例。これらの例では、2つのITS1 rRNA SNPを標識するプローブセットのみを使用しており、rRNA SNP FISHはわずか2つの標的SNPで機能することを示しました。生殖細胞は大きな丸い核によって識別され、体細胞は小さくて丸い核によって識別されます。生殖幹細胞は、アスタリスク(*)でマークされた体細胞ハブのすぐ隣の位置によって識別されます。XおよびYの両方のrDNA遺伝子座からrDNAを転写する生殖細胞は、XおよびY核FISHシグナル(白い点線の円、A-A'')によって同定されます。Y rDNA遺伝子座のみからDNAを転写する生殖細胞は、Y核FISHシグナル(黄色の点線)のみを持っています。Yのみを発現する体細胞は赤い矢印でマークされています。XおよびY rDNA遺伝子座の人工的共標識は、体細胞ハブ(黄色の矢印)で観察できます。スケールバーは10μmです。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67881/67881fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
補足ファイル1:X染色体遺伝子座のrRNA配列。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67881/Dm_45S_rRNA.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

Drosophila melanogasterにおける遺伝子座特異的リボソームRNA転写の一塩基多型感受性FISH検出

In order to ensure sufficient ribosomal RNA (rRNA) is transcribed for ribosome function, genomes contain hundreds of tandem duplications of the sequences ...

single-nucleotide-polymorphism-sensitive-fish-detection-locus

Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

ここでは、ホールマウント蛍光を記述...

ホールマウントRNAを蛍光<em&gt;その場で</emの&gt;ハイブリダイゼーション<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;胚

私たちは、直接標識蛍光プローブを用いた3次元のDNA...

直接標識プローブを用いた堅牢な3DのDNA FISH

高解像度融解分析（HRMA）と合わせPCRは、ゼブラフィッシュの遺伝子型を決定するための迅速かつ効率的な方法として示されている。...

高解像度メルト解析を用いたPCRを使用して、迅速かつ効率的なゼブラフィッシュ遺伝子型決定

本書の目的は、 キイロショウジョウバエの胚、細胞、および組織から抽出されたRNA上の強化されたノーザンブロットプロトコルの手術の手順を視覚化し、議論することである。このプロトコルは、小さなRNA種の効率的な検出のために特に有用である。...

低分子RNA種のノーザンブロット検出における強化キイロショウジョウバエ

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のレア細胞集団からのTRAP-RC、翻訳リボソームアフィニティー精製<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;胚

記載されている RNAその場で交配のプロトコルでは、全体のショウジョウバエの胚または切り裂かれたティッシュで RNA の検出をことができます。96 ウェル マイクロ...

ショウジョウバエの胚とパスチラミドシグナル信号増幅を利用した生体表面の高解像度蛍光In Situハイブリダイゼーション

ここでは、分子ビーコン、スピニングディスク共焦点顕微鏡、オープンソース分析を用いたライブショウジョウバエメラノガスター卵室における内因性mRNA人身売買の可視化、検出、分析、追跡のためのプロトコルを提示する。ソフトウェア。...

ライブショウジョウバエメラノガスター卵室における内因性mRNAの可視化と追跡

この場合の単一分子RNA蛍光蛍光(smFISH)は、単一細胞レベルで特異的なRNAのレベルおよび局在を正確に定量する方法です。ここでは、特定のRNAの単一細胞定量化のためのウェットベンチ処理、イメージングおよび画像解析のための検証済みのラボプロトコルを報告します。...

単一分子FISHによる転写活性アレスの単一細胞解析

ここでは、成功した遺伝子組み換えをマーカーフリーで識別するためにPCRベースの技術を利用し、安定したノックインラインの開発を促進するショウジョウバエの簡略化された内因性遺伝子タグ付けプロトコルを紹介します。...

ショウジョウバエのメラノガスターにおける内在性遺伝子タグ付けのためのワンステップCRISPRベースの戦略

ショウジョウバエ は、筋形成を調節する重要な分子を研究するための確立されたモデルです。しかし、現在の方法では、mRNAの転写動態や合胞体内の空間分布を決定するには不十分です。この制限に対処するために、1分子スケールでのmRNAの検出と定量を可能にするRNA蛍光 in situ ハイブリダイゼーション法を最適化しました。...

ショウジョウバエの1分子スケールでの筋肉転写ダイナミクスの研究

Expansion-Assisted Iterative Fluorescence In Situ Hybridization(EASI-FISH)は、拡大顕微鏡法と蛍光in...

Expansion-assisted iterative Fluorescence In Situ Hybridizationを用いたInsact Drosophila Brainにおける遺伝子発現のマルチプレックス検出

学ぶSNP-FISH法によるDrosophila melanogasterのリボソームDNA遺伝子座特異的転写検出。蛍光顕微鏡でXとY染色体のrRNA転写を区別し、細胞がrDNA量に応じて転写を調節するメカニズムを解明する。

Drosophila melanogasterにおける遺伝子座特異的リボソームRNA転写の一塩基多型感受性FISH検出

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