Drosophila melanogasterにおける遺伝子座特異的リボソームRNA転写の一塩基多型感受性FISH検出

私たちの研究は、細胞がゲノム内の複数のリボソームDNA遺伝子座をどのように感知し、監視し、制御するかを理解することに焦点を当てています。具体的には、どのrDNA遺伝子座が能動的に転写され、その遺伝子座が個々にどのように制御されているのかを区別するメカニズムの解明を目指します。私たちは最近、細胞内のrDNAの量が時間とともに変化することがあり、この変化がどのrDNA遺伝子座を転写するかを変えることを発見しました。

私たちは今、細胞が持っているrDNAの量に基づいてrDNA転写を変化させることを理解しています。この発見は、細胞がどれだけのRDAを持っているかをどのようにして知っているのか、そして細胞がどのrDNA遺伝子座を発現することを好むのかをどのように決定するのかという疑問を私たちに導きます。私たちの研究室では、細胞がさまざまなrDNA遺伝子座を区別し、その活性を感知して制御するメカニズムを理解することに現在注力しています。

実体顕微鏡でショウジョウバエを解剖し、RNaseを含まないPBSで精巣を分離します。まず、1対の鉗子で腹部の中央をつかみ、もう1組の鉗子で腹部の端をつかんで、動物をそっと引き離します。鉗子を使用して、解剖皿から分離された精巣を、0.5ミリリットルのRNaseフリーPBSを含む1.5ミリリットルのマイクロフュージチューブに移します。

PBSを吸引し、1ミリリットルの固定液を追加します。サンプルを室温のニューティングシェーカーに30分間置きます。インキュベーション後、固定溶液を吸引します。

次に、サンプルを1ミリリットルのPBSで2回、各5分間、ニューティングシェーカーで洗浄します。PBSを吸引した後、RNaseを含まない70%エタノール1ミリリットルを加え、サンプルを摂氏4度で一晩中、ニューティングシェーカーでインキュベートします。次に、エタノールを吸引し、サンプルに1ミリリットルの洗浄緩衝液を加えます。

サンプルを室温で、ニューティングシェーカーで3分間インキュベートします。その後、チューブを2分間直立させます。プローブとマスクをハイブリダイゼーションバッファーと混合して、ここに示すようにサンプルあたり合計100マイクロリットルを調製します。

次に、洗浄バッファーを吸引した後、100マイクロリットルのハイブリダイゼーション溶液をサンプルに加えます。透明フィルムを貼ってチューブの端をシールします。チューブをアルミホイルで包んで光から保護し、サンプルを摂氏37度の水浴で少なくとも24時間インキュベートします。

ハイブリダイゼーション溶液を吸引せずに、1ミリリットルの洗浄バッファーをサンプルに加えます。サンプルを摂氏37度の水浴中で暗所で30分間インキュベートします。洗浄バッファーを吸引したら、1ミリリットルの新鮮な洗浄バッファーをサンプルに加え、再度インキュベートします。

インキュベーションの終了時に、洗浄バッファーを吸引し、50マイクロリットルの封入剤をサンプルに加えます。解剖実体顕微鏡の下で、ピペットを使用してサンプルを顕微鏡スライドに移します。鉗子を使用して、顕微鏡スライド上に精巣を一列に並べて配置し、イメージング中のサンプルの識別を容易にします。

サンプルをカバースリップで覆い、カバースリップの端をティッシュワイプで拭き取り、余分な封入剤を取り除きます。カバースリップの端をマニキュアで密封し、室温で10分間暗闇に置いてマニキュアを乾かします。rRNAシグナルは核小体で検出され、特に大きな核と核小体を持つ生殖細胞では、核内のDAPI細孔領域として現れました。

rRNA遺伝子座を欠くサンプルの細胞質に微弱な非特異的シグナルが観察されました。ほとんどの細胞で、YrRNAシグナルのみが検出され、YrDNA遺伝子座からのrRNA転写が示されました。XとYrRNAの共発現は生殖細胞で観察され、シグナルは1つの核に融合するか、2つの核小体に分離しました。