肺線維症のマウスモデルにおけるブレオマイシンの中咽頭投与

私たちの研究は、肺線維症の病因の根底にある免疫メカニズムの理解を目指しています。この分野での最大の課題の1つは、in vitroおよびin vivoモデルをヒト肺線維症に翻訳することです。肺線維症を研究するために、多くの動物モデルが存在します。

私たちは、最も一般的に使用されるモデルの1つであるブレオマイシンマウスモデルを標準化し、他の研究室が容易に使用できるようにすることを目指しています。肺線維症のマウスモデルでブレオマイシンを投与する低侵襲で再現性が高く、安全な方法を紹介します。この動物モデルは、ヒト試験管内での試験を補完するものです。

これには、病因に重要な細胞タイプを稼働させ、損傷時に発生する換気、灌流、およびガス交換の変化を生理学的に再現することが含まれます。in vivo で組織病理学的重症度を大幅に低下させる介入は、より良い臨床転帰を示す可能性があると予測しています。適切な化学療法の予防措置に従いながら、ケミカルフードでブレオマイシン溶液の調製に進みます。.

まず、ブレオマイシン粉末を滅菌PBSに溶解し、1ミリリットルあたり10単位のストック濃度を調製します。使用する特定のブレオマイシンと実験目的に応じて、体重に基づいて必要な用量に従って最終作業濃度を調製します。最終的な投与量を調整するには、ブレオマイシンを0.375単位/ミリリットルに希釈し、25グラムのマウスで合計50ミリリットルを確保します。.

適切に麻酔されたマウスを前切歯で吊るして、手続き型プラットフォームに60〜80度の角度で吊り下げ、中咽頭を効果的に開きます。滑らかな微小血管クランプを使用して鼻腔を閉塞し、中咽頭を通じて呼吸を強制します。鉗子を使用して、舌を中咽頭から引っ込めます。

スタブルアースタブチップ付きのステッパーピペットを使用して、必要な量のブレオマイシンまたは生理食塩水コントロールを中咽頭の後ろに静かに置きます。目に見える液体の泡がはっきりと見えることを確認します。マウスが溶液を吸引するまで、舌を所定の位置に保持し続けます。これは目に見えて、しばしば聴覚的に明らかになります。

誤嚥が確認されたら、ノーズクリップを慎重に取り外します。マウスを吊り下げた状態で15秒間観察し、ブレオマイシン溶液が逆流しないことを確認してからケージに戻します。次に、動物をケージに横向きに置き、その下に加熱パッドを付けて、熱中性を維持します。

つま先をそっとつまみ、動物が目覚めを促進するために優体温のままであることを確認します。マウスが完全に意識を取り戻すまでマウスを監視しますが、これはケタミンの投与量と動物のサイズと代謝に応じて、通常1〜2時間かかります。マウスの体重、グルーミング、活動レベル、呼吸状態の変化を毎日臨床的にモニタリングします。

モデルの有効性を示す重要なマーカーとして、重量を追跡します。適切な時期に、適切に安楽死させたマウスから肺を採取します。組織学では、ブロック上の肺を解剖し、4%パラホルムアルデヒドで24時間固定します。

ヘマトキシリンとエオシン、またはマッソントリクロームを用いたパラフィン包埋、切片化、染色を進めます。可溶性コラーゲンの測定には、右肺を均質化します。フローサイトメトリーでは、組織解離剤と酵素溶液を用いて右肺を消化し、単一細胞懸濁液を得ます。

フローサイトメトリー染色および解析を標準プロトコルに従って実施します。PBS対照と比較して、ブレオマイシンで治療された肺サンプルでは、7日目までに肺胞中隔および小さな炎症性または線維性領域の線維性変化が観察されました。14日目までに、より大きく、より合流性の線維性領域が現れ、正常な肺胞構造が著しく破壊されました。

21日目までに、線維性変化は持続し、それ以上の有意な増加はありませんでした。修正されたアシュクロフトスコアリングシステムは、線維化レベルが14日目と21日目の間で類似していることを確認しました。14日目に実施したヒドロキシプロリンアッセイでは、対照群と比較して、ブレオマイシンで治療した肺の総可溶性コラーゲン含有量の増加が示されました。

定量的ポリメラーゼ連鎖反応分析では、ブレオマイシンに応答してプロフィブロッセイシス遺伝子Col1A1およびTGFBのアップレギュレーションが示されました。フローサイトメトリー解析により、間質性マクロファージ、単球由来肺胞マクロファージ、好中球などの骨髄細胞が肺にしっかりと浸潤していることが明らかになりました。