ヒトCD59/インターメディリシン細胞アブレーションツールを用いた腎マクロファージの急速な枯渇

マウスのヒトCD59発現細胞の中間性物質を介したオブレーションを使用して、腎ミクロファージの再生を研究し、ケモカイン駆動の単球回収と損傷後の免疫監視のニッチな確立に焦点を当てています。私たちの分野での最近の開発は、腎マクロファージ再生のメカニズムを明らかにし、マクロファージを動員する特定のケモカインと、急性腎障害後に免疫監視がどのように再確立されるかを強調しています。タモキシフェン誘導性極低温遺伝学、インターメディアシンアブレーション、マルチパラメータフローサイトメトリー、生体内顕微鏡検査を組み合わせて、腎臓マクロファージをリアルタイムでアブレーション、追跡、視覚化します。

主な課題は、全身性炎症を回避すること、常在するマクロファージのみを標的とすること、デリケートな腎臓の細胞環境を乱すことなく急速な再生を測定することです。単球がアブレーション後7日以内に腎臓マクロファージの88%を回復することを示しましたが、このプロセスはCX3 CR1、CX3 CL1シグナル伝達軸に大きく依存しています。まず、コーン油を摂氏42度に予熱します。

100ミリグラムのタモキシフェンを5ミリリットルの予熱したコーン油に溶解して、1ミリリットルあたり20ミリグラムの濃度のストック溶液を調製します。タモキシフェンを10〜12週齢の雄マウスに体重1グラムあたり100マイクログラムの用量で腹腔内投与します。15日後、体重1グラムあたり120ナノグラムの用量でマウスに中間リシンを単回静脈内注射します。

インターメディリシン投与後 1、3、および 7 日にフローサイトメトリーを実行することにより、常在マクロファージのアブレーションとその後の再生を監視および確認します。腎臓の採取には、細い鉗子とはさみを使用して、安楽死させたマウスの下腹部に水平切開を行います。切開部を正中線に沿って胸郭または胸骨のすぐ下まで垂直に伸ばします。

皮膚と筋肉をそっと引っ込めて胸腔を明らかにします。右心房を切り開いて、血液が循環から排出されるようにします。21〜23ゲージの針を左心室に挿入します。

10〜20ミリリットルの冷たいPBSで灌流を開始し、血液を洗い流します。腎臓が青白く見えるまで灌流を続け、効果的な血液クリアランスを示します。腎臓を体壁の背側に当て、鉗子やはさみを使って周囲の組織からそっと分離します。

腎臓カプセルを切除し、分解を防ぐためにすぐに腎臓を冷たいPBSに入れます。カルシウムとマグネシウムを含まないHBSS、コラゲナーゼIV、DNase Iを混ぜて消化酵素カクテル100ミリリットルを調製します。酵素溶液を新鮮に調製し、使用するまで氷の上に置いてください。滅菌ハサミを使用して、5ミリリットルのHBSSを含むペトリ皿で腎臓を小さな断片に細かく刻みます。

みじん切りにした腎臓組織を、調製した酵素溶液10ミリリットルの入った15ミリリットルのチューブに移します。次に、チューブを摂氏37度で30分間インキュベートし、穏やかに攪拌して組織を解離させます。ピペットまたはシリンジプランジャーを使用して組織を穏やかに粉砕し、細胞の塊をさらに分解します。

細胞懸濁液を40マイクロメートルの細胞ストレーナーに通して破片を取り除きます。細胞懸濁液を摂氏18度で10分間700Gで遠心分離します。次に、バッファーを慎重にデカントします。

ペレットを5ミリリットルの溶解バッファーに再懸濁してから、室温で5分間インキュベートして赤血球を溶解します。PBSを加えて細胞を洗浄し、溶解バッファーを除去します。得られた単一細胞懸濁液を、さらに使用するまで氷上に維持します。

密度勾配遠心分離の場合は、まず細胞ペレットを10ミリリットルの30%密度勾配溶液に再懸濁します。これを遠心分離管内の3ミリリットルの70%密度勾配溶液に慎重に重ねます。グラジエントを500 Gで30分間遠心分離し、休憩を適用しません。

遠心分離後、30%溶液と70%溶液の間の界面層を注意深く収集します。収集した細胞を10ミリリットルのPBSで2回洗浄し、各洗浄液を500 Gで10分間遠心分離します。最終細胞ペレットを1.5ミリリットルのチューブ内の1ミリリットルのFACSバッファーに再懸濁します。

明視野顕微鏡下で血球計算盤を使用して細胞をカウントし、細胞濃度を10の2倍に10の6つの細胞の累乗に調整します。650 Gで5分間遠心分離して1.5ミリリットルチューブに細胞をペレット化し、細胞ペレットを1ミリリットルのFACSバッファーに再懸濁します。抗CD16または32抗体を1〜200希釈で添加して、非特異的FC受容体結合をブロックします。

細胞を摂氏4度で15分間インキュベートした後、アクアライブ/デッド色素と、CD45 E 450、CD11 B PE SI7、HCD59 PE、およびF4 / 80 BV 605を含むプレコンジュゲート抗体カクテルで細胞を染色します。抗体カクテルを細胞懸濁液に直接加えます。蛍光色素を保護するために、サンプルを暗所で摂氏4度で30分間インキュベートします。

次に、細胞をFACSバッファーで2回洗浄します。細胞を1%パラホルムアルデヒドで氷上で30分間固定します。次に、細胞をFACSバッファーで2回洗浄して、残留固定液を除去します。

フローサイトメーターを使用して染色および固定された細胞を取得します。ソフトウェアを使用してデータを分析します。マーカーCD45、CD11B、およびF4 / 80を使用して、腎臓およびその他の組織に常在するマクロファージとミクログリアを同定します。

初期ゲーティングを実行して、前方散乱プロファイルと横方散乱プロファイルを使用して生細胞を選択します。前方散乱領域と高さゲーティングを使用してダブレットを排除します。生存率色素を使用して死んだ細胞を除外します。

CD45陽性集団をゲーティングすることにより免疫細胞を濃縮します。ゲーティング戦略に示されているように、腎常在マクロファージをCD45陽性ゲート内のCD11b+F4/80hi細胞として定義します。ミクログリア集団をCD11b+CD45中間細胞として定義し、最終解析を行います。

SDSページゲルで54キロダルトン付近で1つの顕著なタンパク質バンドが観察され、組換え中間体の純度と予想される分子量が確認されました。精製された中間リシンは、用量依存的に強力な溶血活性を示し、7.24ナノグラム/ミリリットルで50%の赤血球溶解を達成し、650ナノグラム/ミリリットルでほぼ完全な溶解を達成しました。フローサイトメトリー分析により、誘導性ヒトCD59化合物cre-Rマウスの腎マクロファージの成功と選択的枯渇が確認され、中間リシン投与の1日後、対照マウスでは枯渇が見られませんでした。

腎マクロファージは3日目までに再増殖し始め、7日目までに元の個体群の約88%に回復しました。新しく再生された腎マクロファージのわずか5%が7日目までにヒトCD59を発現しており、再増殖が主にその場増殖ではなく単球動員を介して発生したことを示しています。