Drosophila melanogasterにおける神経回路の光遺伝学的操作のための行動アッセイ

私たちの研究では、光遺伝学ツールを使用して、Drosophila melanogasterの神経回路がサーモタクシーや妊娠などの行動をどのように制御しているかを研究しています。特定のニューロンを光で制御することで、これらの回路がどのように感覚応答を駆動し、意思決定に影響を与えるのかを高精度に理解することを目指しています。オプトジェネティクスは、光を用いて神経活動を正確に制御する神経科学における貴重な技術です。

Drosophila melanogasterでは、CsChrimsonやGtACR2などのツールにより、ニューロンの標的活性化と阻害が可能になります。これらのツールにより、研究者は神経回路を操作し、行動を研究し、センサーの応答を高い特異性で探索することができます。当社のプロトコルは、ショウジョウバエの光遺伝学的操作に対するシンプルで費用対効果が高く、再現性のあるアプローチを提供します。

市販の材料を使用しているため、リソースが限られている研究室や教室でアクセスできます。また、この手法は適応性が高く、技術的な課題を最小限に抑えながら、魅力的な行動と回避行動の研究を可能にします。まず、オスとメスのショウジョウバエを入手し、加熱セルでGtACR2を発現させます。

2つの鋼板を別々のホットプレートに揃えて、端が合うようにします。プラスチックシートプロテクターを上に置き、テープで固定して動きを最小限に抑えます。次に、シートプロテクターに白い紙を置いてバックグラウンドノイズ信号を減らし、白い紙の上に透明なプラスチックカバーを置きます。

次に、発泡スチロールの箱の底に穴を開けて、実験面から約12センチメートル上にカメラと青色光を収めます。カメラとブルーライトをまぶしさを最小限に抑えながら、アクティベーションを確保します。カメラを 1 秒のタイムラプス、狭いフィールド、解像度 4 、 000 x 3 、 000 ピクセルで録画するように設定します。

ホットプレートの設定を調整して、それぞれの鋼板の表面温度を摂氏25度またはマイナス1度、摂氏31度またはマイナス1度に維持します。各試験の前後に、表面温度プローブを使用して鋼板の温度を監視します。次に、25°Cの鋼板にプラスチックカバーを載せます。

次に、ハエ吸引器を使用して、カバーの下に1つのハエをそっと放出します。実験エリアの上にボックスを配置して、10ルクス未満の薄暗い光を作り出し、フライを1分間順応させます。順応期間が経過すると、ボックスを持ち上げ、カバーの中心が鋼板の境界に合うようにプラスチックカバーをすばやく調整します。

試用を開始し、カメラと20キロルクスで青色のライトをオンにします。ハエの活動を2分間キャプチャします。2分後、カメラと照明をオフにしてください。

ハエは吸引器を使用して処分します。氷上の甘味受容体ニューロンでCsChrimsonを発現する飢餓状態のオスとメスのハエを麻酔します。スライドガラスに7〜10個の小さなドットの接着剤を塗ります。

各接着剤のドットに1つのフライの腹側を上にして配置し、胸部と翼が接着剤に接触して動きを最小限に抑えるようにします。翼を両側に扇状に広げて、接着表面積を増やします。濡れたペーパータオルを湿度ボックスに入れ、スライドをボックスに移します。

2時間の回収後、スライドを顕微鏡下に置きます。注射器を使用して水滴を送達し、ハエを満足させ、喉の渇きによる吻の伸展を防ぎます。手動で赤いレーザーポインターを保持し、700ルクスで単一のフライの吻または頭に赤い光を当てます。

30秒以内に顕微鏡を通してテングの伸長応答を観察します。光誘起吻伸長をテストした後、4%スクロースに対する応答を調べます。シリンジ針の端にあるスクロースの液滴を排出し、ハエの吻に近づけます。

まず、実験用のハエの迷路を組み立てます。暗い場所や暗い場所では、オス10匹とメス10匹のCsChrimson発現フライをローディングチューブに入れ、保持チャンバーに接続します。エレベーターを傾け、チューブを軽くたたいて、ハエを保持チャンバーに移動します。

フライをホールディングチャンバーに移した後、エレベータを使用してローディングチューブと試験管の穴の間にハエを下げます。次に、ローディングチューブを取り外します。ライトをオンにせずに、フライ迷路を1, 000ミリアンペアの赤色光源から約13センチメートル離して配置します。

ホールディングチャンバーが試験管の穴と揃うまでエレベータを下げ、ホイルで包まれた試験管と覆われていない試験管の間をフライが自由に移動できるようにします。同時に、約40キロルクスで赤色のライトを点灯して、CsChrimsonをアクティブにします。ハエが赤色の光にさらされたチューブと影付きのチューブのどちらかを1分間選択できるようにします。

1分後、ローディングチューブと試験チューブの穴の間のエレベーターを上げます。各チューブからハエを取り外します。それらを数え、番号を記録します。

各試験の後に、蒸留水を使用してフライエレベーターとフライ迷路を清掃します。ブルーライト、オプトジェネティクス、サーモタクティクス、位置選好アッセイでは、ハエは対照条件下で摂氏31度側を避けましたが、ATR補給を施したブルーライトでは、ハエは摂氏25度から31度の間で選好を示さず、GtACR2活性化によるHCニューロンの阻害を示しました。対照条件下では、ハエは最小限の吻拡張応答を示しましたが、ATR補給による赤色光の活性化は有意な吻の拡張をもたらし、CsChrimsonによる甘味感知ニューロンの活性化を実証しました。

赤色光、光遺伝学、ハエ迷路アッセイでは、対照群は好みを示さなかったが、ATR補給による赤色光の活性化により、ハエは覆われていないチューブを避けるようになり、CsChrimsonによる苦味感知ニューロンの活性化が示された。