Name: カテーテル関連尿路感染症の In vitro 膀胱モデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: 学ぶカテーテル関連尿路感染症のin vitro膀胱モデルによるバイオフィルム形成制御と抗菌薬効果評価の手法。このモデルは医療機器開発と患者予後改善に貢献します。

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<table><tbody><tr><td>313 ラピッドロードポンプヘッドエクステンション</td><td>Watson-Marlow</td><td>313</td><td>蠕動ポンプ - 追加のポンプヘッドエクステンション&nbsp;</td></tr><tr><td>323S/D手動制御可変速ポンプ</td><td>Watson-Marlow</td><td>323S/D</td><td>蠕動ポンプ</td></tr><tr><td>3Lベッドバッグ、レバータップ付き滅菌&nbsp;</td><td>グレートベアヘルスケア&nbsp;</td><td>GDW173</td><td></td></tr><tr><td>内径3mmプラチナ硬化シリコーンチューブ</td><td>フィッシャー</td><td>10111801</td><td>小型AUM回路チューブ(ポンプチューブをモデルに接続)</td></tr>内<tr><td>径5mmプラチナ硬化シリコンチューブ</td><td>フィッシャー</td><td>10539201</td><td>中AUM回路チューブ(ポンプチューブをAUMリザーバーに接続)</td></tr><tr><td>塩化アンモニウム(NH4Cl)</td>フィ<td>ッシャー</td><td>11473713</td><td></td></tr><tr><td>無水硫酸ナトリウム (Na2SO4)</td><td>Fisher</td><td>11498717</td><td></td></tr><tr><td>Azlon テーパーコネクタ&nbsp;</td><td>フィッシャー</td><td>10712807</td><td>AUM回路の異なる長さのチューブを接続するために使用されます</td></tr><tr><td>ベッドバッグハンガー&nbsp;</td><td>グレートベアヘルスケア&nbsp;</td><td>10705P</td><td></td></tr><tr><td>Bochem ピンチ コック チューブ クランプ、直径 25 mm</td> フィ<td>ッシャー</td><td>11805101</td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム (CaCl2)</td><td>フィッシャー</td><td>10021681</td><td></td></tr><tr><td>クエン酸一水和物&nbsp;</td><td>メルク</td><td>C1909-500G</td><td>実験後のモデルから結晶バイオフィルムを除去するために使用されます&nbsp;</td></tr><tr><td>フィッシャーブランド&nbsp;ガラス目盛り付きクラスBタイプ1ピペット</td><td>フィッシャー 11992168</td><td></td><td>穴あけ栓ゼラチンを介してAUMのin vitroブレーダーモデルを供給するために使用されます</td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>24360.233</td><td></td></tr><tr><td>Graphpadプリズム10</td><td>GraphPad</td><td>V10.0</td><td>in vitro膀胱モデルの結果と統計分析をグラフ化するために使用される分析ソフトウェア。</td></tr><tr><td>ハンナ HI 2211-02 pH 卓上メーター</td><td>フィリップ ハリス&nbsp;</td><td>PP00057414</td><td></td></tr><tr><td>In vitro 膀胱モデル&nbsp;</td><td>-</td><td>-</td><td>Nzakizwanayo et al. (2019) によって以前に説明されたように、特注の機器。</td></tr><tr><td>Instillagel 6 mL 潤滑剤ゲル</td><td>mydoctorshop.co.uk</td><td>40-006</td><td>セクション 7.1 で使用した潤滑剤ゲル。他のサプライヤーも入手可能です。</td></tr><tr><td>Kartell Plastilab 不均一テーパーコネクタ</td><td>Fisher&nbsp;</td><td>11914289</td> 塩なしの異なる直径のマッコンキー寒天培地(脱水)<td>のチューブを接続するために使用</td></tr>フィ<tr><td></td><td>ッシャー</td><td>10472643</td>群<td>がる細菌の単一コロニーの計数用、すなわちプロテウスミラビリス</td></tr>塩化<tr><td>マグネシウム六水和物(MgCl2.6H2O)</td><td>フィッシャー</td><td>10386743</td><td></td></tr><tr><td>リン酸一カリウム(KH2PO4)</td><td>Fisher</td><td>10573181</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Y字型コネクタ</td><td>Fisher</td><td>10186070</td><td>1つのAUMリザーバーから複数のAUM回路を実行するために使用されます(タンクごとに1〜4モデル)&nbsp。</td></tr><tr><td>塩化カリウム (KCl)</td><td>フィッシャー</td><td>10375810</td><td></td></tr><tr><td>パイレックス アスピレーター ボトル、すりガラス サイド ソケット付き、容量: 5000 mL</td><td>フィッシャー</td><td>11347884</td><td>AUM リザーバー</td></tr><tr><td>ボア付きゴム栓、外径: 37mm、赤、直径: 37mm</td><td>フィッシャー</td><td>11517612</td><td>AUM リザーバーで使用され、AUM</td></tr> <tr><td>を備えた in vitro モデルを供給するために使用サイズ14 フレンチ100%シリコンフォーリーカテーテル、インフレーション用滅菌水シリンジ付き&nbsp;</td><td>グレートベアヘルスケア&nbsp;</td><td>4833-0514</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム (NaCl)</td><td>フィッシャー</td><td>10735921</td><td></td></tr><tr><td>シュウ酸ナトリウム (Na2C2O4)</td><td>Fisher</td><td>10442211</td><td></td></tr><tr><td>Teknon Biocleanse 濃縮殺生物性クリーナー 5L&nbsp;</td><td>フィッシャー 12447580</td>実験<td></td><td>後のモデル滅菌に使用</td></tr><tr><td>クエン酸三ナトリウム (Na3C6H5O7)</td><td>フィッシャー</td><td>11434993</td><td></td></tr><tr><td>トリプトン大豆ブロス</td><td>フィッシャー</td><td>10198002</td><td></td></tr><tr><td>尿素(CH4N2O)</td><td>フィッシャー</td><td>10404185</td><td></td></tr><tr><td>Uro-Tainer M NaCl 0.9%</td><td>B.Braun</td><td>FB99833</td><td>セクション 7.2 で使用される生理食塩水膀胱洗浄ポーチ。</td></tr><tr><td>ワトソン・マーロウ ポンプシル 内径1.6mmプラチナ硬化シリコーンチューブ</td><td>フィッシャー</td><td>12406280</td><td>厚いAUM回路チューブ(パースタルティックポンプ用)</td></tr></tbody></table>

カテーテル関連尿路感染症の in vitro 膀胱モデル

An In Vitro Bladder Model of Catheter-Associated Urinary Tract Infection

in vitro膀胱モデルの運用が成功するかどうかは、優れた無菌技術を実践し、実験全体を通じて培地の濁度を注意深く観察することにかかっています(図3)。接種前、滅菌AUMは淡黄色で、in vitro膀胱モデルの中央チャンバー内では透明でした(図3A)。培地リザーバー内のAUMは、濁度の変化が発生すると、溶液からの塩の沈殿や培地の汚染を示している可能性があるため、実験中は常に透明に保つ必要があります。メディアリザーバーまたはメディア回路チューブのAUMが曇ったり、色が急激に変化したりした場合は、レプリケートを破棄して繰り返す必要があります。接種後、in vitro膀胱モデル中央チャンバー内のAUMの濁度の増加がはっきりと見えます(図3B)。濁度の変化は、P. mirabilisなどのウレアーゼ陽性生物でより顕著であることがよくありますが、ウレアーゼ陰性生物では接種後も目に見えるはずです。.AUMフローが開始された後、プランクトン細胞が洗い流されるときにAUMの濁度の減少が観察されることが多く、モデルに生存細胞が不足していることを示すものではありません。中央チャンバー内の培地レベルを観察することは、ウレアーゼ陽性生物を利用する場合の閉塞時間を決定するためにも使用できます(図3C)。モデルが稼働しているときは、カテーテルのアイホールと先端が完全に見えるようにして、廃棄物バッグに適切に排出されていることを示す必要があります。閉塞すると、中央チャンバー内のAUMのレベルがカテーテルのアイホールと先端より上に上昇し、実験がエンドポイントの読み取りと終了の準備ができていることを示します。実験中、in vitro膀胱モデル培地回路の圧力効果により、モデルが詰まって見えることがあります。閉塞が疑われる場合は、チューブ内の気泡やねじれが「エアロック」を引き起こし、カテーテルの排出を妨げる可能性があるため、アッセイを終了する前にAUM回路、カテーテル、および廃液バッグチューブがぴんと張っていることを確認してください。
in vitro膀胱モデル実験では、プランクトンサンプリングにより、モデル内の成長ダイナミクスとCAUTIの進行に関する貴重な洞察を得ることができます。細胞増殖、pH、バイオフィルム形成はすべて、モデルを終了させることなく、実験全体を通じて監視できます(図4)。ウレアーゼ陽性生物を使用する場合、閉塞時間の計算をバイオフィルム形成速度の尺度として利用し、異なる細菌株の特性を比較するために使用できます(図4)。P. mirabilisの野生型株とLPS変異体(mini-tn5 waaCへの挿入)の比較では、ブロックまでの時間が延長され、変異体でのバイオフィルム形成が減少したことが示されました(図4)。ウレアーゼ陰性生物は通常、in vitro膀胱モデルをブロックしないため、実験前に設定されたエンドポイントを決定することをお勧めします。場合によっては、ウレアーゼ陰性菌がカテーテル閉塞を引き起こす可能性があります。例えば、肺炎桿菌のウレアーゼ陰性株は、広範囲のムコイドバイオフィルムを生成することができますが、これらは通常、ウレアーゼ陽性バイオフィルムよりもはるかに長い時間をかけて排液をブロックするため、エンドポイントを設定することが推奨されます。
膀胱モデルの実験全体でpHを測定することで、ひずみ間の違いやCAUTIの進行状況についての洞察も得られます。ウレアーゼ陰性菌を利用する場合、 in vitro 膀胱モデルの中央チャンバー内のpHは実験全体を通じてほぼ安定しているはずですが、実験の過程で集団動態が変化するため、pHのわずかな変動が予想されます。 in vitro モデルにウレアーゼ陽性生物を接種すると、時間の経過とともにpHが大幅に上昇し、通常、閉塞時に最も高いpHが観察され、~8-9という高いpH測定値が観察されます(図4B)。
浮遊性CFU/mLの計数化は、in vitro膀胱モデリングの重要な要素であり、オペレーターは接種が成功したかどうかを評価し、実験の進行状況を監視することができます。実験の最後にCFU/mLを測定することで、異なる細菌株間の膀胱コロニー形成の違いを明らかにすることができます。P. mirabilisのmini-Tn5変異株を野生型と比較したところ、閉塞時のCFU/mLの有意な減少が観察されました(図4C)。さらに、カテーテル表面のバイオフィルムからCFUを列挙し、バイオフィルムバイオマスを定量化することで、カテーテルを装着した尿路にコロニーを形成するさまざまな病原体の能力についての洞察を得ることができます。クリスタルバイオレット染色を使用して、野生型P.ミラビリスHI4320株とクロルヘキシジンで継代した分離株との間のバイオフィルム形成の違いを決定しました(図5)。595 nmでの光学密度測定により、クロルヘキシジンで継代した分離株は、クロルヘキシジンの非存在下で可決された野生型および対照群と比較してバイオフィルム形成の減少を示したことが示されました。
in vitro膀胱モデルの目的はCAUTIニッチを正確に再現することであるため、モデルは、臨床的に関連性のある環境でCAUTIを治療することを目的とした抗菌治療薬の効果を研究するためにも利用できます。ウレアーゼ陽性生物の場合、処理済みモデルと未処理モデルの閉塞時間を比較することで、治療の有効性に関する有用な洞察を得ることができます。P. mirabilisを0.02%クロルヘキシジン膀胱洗浄液で接種したin vitro膀胱モデルの処理は、未処理または0.9%生理食塩水で処理したモデルと比較して、閉塞までの時間を有意に延長しました(図6A)。さらに、in vitro膀胱モデルは、抗菌治療薬の殺菌活性を研究するために利用することができます。抗菌治療後のプランクトン性およびバイオフィルム関連細胞のCFU/mLの変化をモニタリングすることで、治療が有効かどうかを示すことができます。P. mirabilisを接種したin vitro膀胱モデルの処理では、メーカーの指示に従って適用した場合、未処理の0.9%生理食塩水灌漑モデルと比較して、治療直後のプランクトンCFU / mLが&gt;7 log減少したことが示されました(図6B)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67966/67966fig01.jpg"> 
図1: in vitro 膀胱モデルの主要コンポーネントの概略図。 (A)膀胱モデル(クローズドドレナージシステム):(1)膀胱をシミュレートする二重壁ガラスチャンバー (2)メディアインレット、AUは蠕動ポンプ を介して 膀胱モデル内部チャンバーに供給されます (3)循環水浴 を介して 外部チャンバーに供給される水入口 (4)水出口 (5)フォーリーカテーテル、内部チャンバーに挿入されます (6)ドレナージルーメン接続ポイント;ゴミ袋/灌漑ポーチの接続ポイント (7) 尿の流出を収集する排水バッグ。(B) in vitro 膀胱モデルのセットアップと、モデルを通る媒体と水の流れの方向を示す概略図。人工尿は、室温で培地リザーバー(1)に保存され、実験期間中、蠕動ポンプ(2) を介して ~0.75 mL min-1 の一定流量でモデルに供給されます。培地は、膀胱(3)を表す二重壁のガラス容器の中央チャンバーに流れ込み、フォーリーカテーテル(4)のアイホール を通って ドレナージバッグ(5)に排出され、滅菌クローズドドレナージシステムが完成します。 in vitro 膀胱モデルは、二重壁ガラス容器の外側のチャンバーを流れる循環水浴(6) を介して 37°Cの一定温度に保たれます。破線はシリコンチューブを表し、矢印は流れの方向を表します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67966/67966fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67966/67966fig02.jpg"> 
図2:バイオフィルム関連細胞を処理するための尿道カテーテルの切片化。 下流のバイオフィルム定量のための解剖用の尿道カテーテル上のサンプルポイント。(A)カテーテルは、最初に先端/アイホールに近位の8cm領域(ほとんどのバイオフィルム形成が観察される場所)で横方向に切片化されます。1cmの切片をメスで除去しますが、一般的には、処理の再現性が難しいため、収縮したカテーテルバルーンを含む領域を避けます(1-3)。(B)カテーテルが最初に1cmの断片に切片化されたら、中央の内腔に別の縦方向の切断が行われ、さらなるバイオフィルム定量、すなわち結晶紫色染色のCFU/mL列挙のために存在するバイオフィルムが露出します。破線は解剖点を表します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67966/67966fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67966/67966fig03.jpg"> 
図3:in vitro膀胱モデル実験の段階。 実験のさまざまな段階にわたるin vitro膀胱モデルの中央チャンバーの画像。(A)接種前のin vitro膀胱モデル中央チャンバー内のAUM。中央チャンバー内の培地は完全に透明で、滅菌が成功したことを示しており、カテーテルの先端とアイホールは培地の線の上に見え、カテーテルが正常に排出されていることを示しています。(B)P.ミラビリスの接種後(接種後4時間)後のin vitro膀胱モデル中央チャンバー内の培地。接種の成功は、培地の濁度の増加によって示されます。カテーテルの先端とアイホールの視認性は、AUMがカテーテルを介して正常に排出されており、閉塞が発生していないことを示しています。(C)閉塞したin vitro膀胱モデルの一例。P. mirabilis の接種とそれに続くバイオフィルムの形成と石灰化により、カテーテルのアイホールが閉塞し、ドレナージが妨げられ、中央チャンバー内の媒体のレベルがカテーテル先端より上に上昇しました。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67966/67966fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67966/67966fig04.jpg"> 
図4:in vitro膀胱モデルのエンドポイント測定は、閉塞するまで実行しました。 P. mirabilisの臨床株RS47(WT)と、バイオフィルム形成が弱毒化された変異株RS47-2(変異体)を接種したin vitro膀胱モデルからの閉塞時のエンドポイント測定の例。(A)WTおよびP.mirabilisの変異株の閉塞時間(h)。(B)閉塞時のin vitro膀胱モデルのpH。(C)閉塞時のin vitro膀胱モデルチャンバー内のプランクトン細胞のCFU/mL。すべてのデータは、5回の生物学的複製の平均を表しています。エラーバーは、平均の標準誤差(SEM)を示します。*p ≤ 0.05;**p ≤ 0.01.この図は、Clarke et al.46から修正されています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67966/67966fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67966/67966fig05.jpg"> 
図5:in vitro膀胱モデルからのバイオフィルム関連細胞測定。 P. mirabilisのバイオフィルム形成の定量化、野生型HI4320株とクロルヘキシジン(CHD)の有無にかかわらず、結晶紫色染色および595nmでの光学密度(OD)の測定による適応集団の比較。WT:P.ミラビリスHI4320;1、3、5:CHD曝露のない通路制御。2、4、6:HI4320を4μg/ mL CHDで継代。すべてのデータは、5回の生物学的複製の平均を表しています。エラーバーはSEMを示しています。 *p ≤ 0.05;** p ≤ 0.01.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67966/67966fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67966/67966fig06.jpg"> 
図6:抗菌治療後のin vitro膀胱モデルからの測定値。プランクトンサンプルは、0.02% クロルヘキシジン抗菌溶液 (100 mL) または 0.9% 生理食塩水コントロールによる灌漑後に、P. mirabilis を接種した in vitro 膀胱モデルから採取しました。(A)灌漑後のin vitro膀胱モデルの閉塞時間。(B)灌漑処理直後のプランクトン性CFU / mL。すべてのデータは、5回の生物学的複製の平均を表しています。エラーバーはSEMを示します。 *p ≤ 0.05;**p ≤ 0.01;*p ≤ 0.0001 です。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67966/67966fig06large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

カテーテル関連尿路感染症の In vitro 膀胱モデル

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