フローサイトメトリーを用いた損傷脊髄のミクログリアおよび末梢浸潤マクロファージの同定

脊髄損傷におけるミクログリアと浸潤マクロファージを同定し、最適化されたフローサイトメトリーを用いて神経炎症におけるそれらの役割を明らかにしました。フローサイトメトリーと密度勾配遠心分離は、中枢神経系免疫細胞を高い特異性と効率で単離し、表現型決定するための鍵となります。形態学的に類似したミクログリアとマクロファージを区別し、単離中の細胞損失を最小限に抑え、動的損傷微小環境における微小特異性の劣悪が依然として重要なハードルです。既存の方法では、常在ミクログリアを浸潤マクロファージから確実に分離することができません。私たちのマーカーベースのアプローチは、脊髄損傷研究におけるこの重大な制限を解決します。

[プレゼンター]まず、互換性のあるソフトウェアを備えたフローサイトメーターを使用してアイソタイプコントロールチューブを分析します。前方散乱電圧と側方散乱電圧を調整して、細胞集団を適切な範囲内に配置します。X軸にIgG APC、Y軸にIgG PE、X軸にIgG-FITC、Y軸にIgG APC-Cy7の2つのグラフを追加します。次に、IgG APC、IgG PE、IgG FITC、およびIgG APC-Cy7の蛍光チャネル電圧を調整して、細胞集団を二重陰性領域の10の3乗以内に配置します。アイソタイプコントロールチューブを使用して最適化された電圧を確認した後、すべての設定を保持します。抗体染色した実験管の分析に進みます。CD11b PEをX軸に、Y軸に側方散乱を描いたグラフを作成します。CD68 FITC と CCR7 APC-Cy7 で別のグラフを設定します。アイソタイプコントロールを基準として使用して、CD11b陽性領域を描写し、それをP1ゲートとして定義します。CD68 FITC と CCR7 APC-Cy7 グラフを選択します。右クリックして「母集団の表示」を開き、F4列をP1に割り当てます。データを取得した後、必要に応じて蛍光補正を調整します。CD11b CD68 CCR7陽性およびCD11b CD68陽性CCR7陰性細胞集団の割合を分析および記録します。アイソタイプコントロールチューブからの電圧設定を使用して、実験チューブの分析を開始します。CD45 APCとCD11b PEでグラフを作成します。次に、CD68 FITC と CCR7 APC-Cy7 で 2 つのグラフを設定します。サンプルあたり50,000イベントを取得し、データ収集後に蛍光補正を調整します。CD45とCD11bの疑似カラープロットで、CD11b陽性、CD45陰性低細胞、CD11b陽性CD45高細胞の領域を特定して分析します。次に、各領域内のCD68陽性CCR7陽性およびCD68陽性CCR7陰性集団を分析します。すべての分析を統合して、定義された領域にわたるM1様およびM2様ミクログリアとマクロファージの割合を決定します。フローサイトメトリー解析ソフトウェアを起動します。フローサイトメトリー実験ファイルをインターフェイスの[すべてのサンプル]セクションにドラッグします。アイソタイプコントロールサンプルをダブルクリックして、2次元ドットプロットを開きます。X軸にFSCA、Y軸にSSCAを選択し、長方形のゲートボタンをクリックして、細胞破片を除く領域を選択します。ゲート領域をダブルクリックして、新しいヒストグラムプロットを開きます。次に、X軸にFITCを選択し、Y軸にヒストグラムを選択します。領域ゲートボタンをクリックして、負の蛍光シグナルと正の蛍光シグナルの間のしきい値を定義します。4つの蛍光抗体のそれぞれについて、アイソタイプコントロールサンプルを使用して、陰性シグナルと陽性シグナルの間の閾値を決定します。Y軸のヒストグラムを維持しながら、X軸蛍光色素をPE-APCおよびAPC-Cy7に順次変更します。各ヒストグラムの領域ゲートツールを使用して、4つの抗体の陰性および陽性蛍光シグナルを区別するためのゲートを最終決定します。次に、実験サンプルをダブルクリックしてドットプロットを開きます。X軸にFSCA、Y軸にSSCAを選択し、長方形のゲートボタンをクリックして、破片を取り除いた後に個体群をゲートします。ゲート領域をダブルクリックして、新しいドットプロットを開きます。X軸にCD11b PEを選択し、Y軸にSSCAを選択します。長方形のゲートボタンをクリックし、アイソタイプコントロールのPEしきい値を使用してCD11b陽性ゲートを定義します。次に、CD11b陽性領域をダブルクリックして別のドットプロットを開き、X軸にCD68 FITCを選択し、Y軸にCCR7 APC-Cy7を選択します。クロスゲートボタンをクリックし、アイソタイプ由来のFITCおよびAPC-Cy7閾値を使用して、細胞をM1様型とM2様型に分類します。CD45 高 CD11b 陽性 CD68 陽性 CCR7 陽性細胞の割合は、偽グループと比較して脊髄損傷 (SCI) ビヒクル群で有意に増加し、CRID3 治療はこのレベルを変更しませんでした。 CD45陰性、低CD11b陽性、CD68陽性、CCR7陽性細胞の割合は、偽と比較してSCIビヒクル群で有意に高く、CRID3治療後に有意に減少しました。CD11b 陽性 CD68 陽性 CCR7 陽性細胞の割合は、偽と比較して SCI ビヒクル群で有意に増加し、CRID3 処理後に有意に減少しました。CD11b 陽性 CD68 陽性 CCR7 陰性および CD45 陰性 低 CD11b 陽性 CD68 陽性 CCR7 陰性の細胞比率は、偽と比較して両方の SCI ビヒクル群で有意に減少し、CRID3 治療後に増加しました。