フローサイトメトリーによる幼若魚イタドリ頭部腎臓白血球の単離、固定および特性評価

このプロトコルは、フローサイトメトリーによる金頭鯛の頭部腎臓からの白血球の単離、固定、および生存率評価を標準化し、品質を損なうことなくハイスループットのサンプル処理を可能にします。

ノイバウアーチャンバーによる手動細胞計数や染色血液塗抹標本などの伝統的な技術は、魚の免疫学では一般的です。フローサイトメトリーは普及しつつありますが、魚類研究への応用は依然として限られています。従来の魚の免疫学的手法は肝臓を大量に消費し、エラーが発生しやすいです。若年動物研究は、純粋な白血球の取得における課題と即時の生存率評価の必要性によって制限されており、サンプルのスループットが制限されています。

このプロトコルは、主要な白血球集団を特定し、生細胞と死細胞を区別することにより、詳細な免疫細胞分析を可能にします。固定により生存率が 1 か月間維持され、スケーラブルで柔軟かつ効率的なフローサイトメトリー ワークフローが可能になります。

私たちの発見は、免疫メカニズムと細胞生存率に対する環境への影響を明らかにすることで魚の免疫学を進歩させ、水産養殖における改善された病気管理戦略の開発を支援します。

[ナレーター]まず、金頭鯛の稚魚を順応させます スパラスオーラタ、安定した環境を維持するために水が継続的にろ過および再循環される再循環水産養殖システム。最適な非生物的パラメータを維持するために、システムに機械的および生物学的濾過、曝気、温度制御が含まれていることを確認してください。研究の特定のニーズに応じて、光周期、温度、塩分濃度、pH、溶存酸素レベルなどの環境要因を調整します。網を使って、金鯛の稚魚をタンクの水で満たされた一時的な保持容器にそっと移します。魚を安楽死させた後、1匹の魚を無菌解剖トレイに横向きに置きます。メスで、通気口から鰓に向かって魚の腹側正中線に沿って慎重に切開します。解剖はさみを使用して切開部を伸ばし、内臓を露出させます。体腔の前背側領域近くの鰓のすぐ後ろに位置し、脊柱の下の上側に沿って伸びている頭腎を見つけます。先端の細い鉗子とはさみを使用して、周囲の組織を注意深く取り除き、頭の腎臓をよりよく視覚化します。次に、頭の腎臓を持ち上げ、その周りに正確に切り込みを入れて、周囲の組織から解放します。切除した頭腎臓を、滅菌ペトリ皿内に配置された細胞ストレーナーにすぐに入れます。2ミリリットルのハンクス平衡塩溶液(HBSS)を滅菌ペトリ皿でピペットで移動させます。シリンジのプランジャーを使用して、切除した頭腎臓を細胞ストレーナーで浸軟させ、細胞を溶液に放出します。次に、密度勾配培地溶液を調製します。600マイクロリットルの密度勾配媒体溶液を5ミリリットルのポリスチレン丸底チューブにピペットで入れます。2ミリリットルの細胞懸濁液をペトリ皿から各チューブにゆっくりと移します。ブレーキを切った状態で摂氏4度で400gで45分間遠心分離します。遠心分離後、チューブを取り外し、白血球リングを観察します。次に、滅菌パスツールピペットを使用して、約100マイクロリットルの白血球リングを2ミリリットルの微量遠心チューブに穏やかに移します。次に、HBSSで容量を2ミリリットルに増やし、細胞を穏やかに再懸濁します。サンプルを摂氏4度で10分間400gで遠心分離します。遠心分離後、チューブの底にあるペレットを乱さずに上清を慎重に廃棄します。次に、精製したペレットを1ミリリットルのHBSSに再懸濁し、最終的な細胞濃度が1ミリリットルあたり10,000〜100万個の細胞になるまで。反応性色素の入ったバイアルに50マイクロリットルのジメチルスルホキシドを加えます。細胞密度を1ミリリットルあたり100万個の細胞に調整した後、1ミリリットルの細胞懸濁液を2ミリリットルの微量遠心チューブに移します。与えられたとおりに生存率制御サンプルを調製します。チューブ3と4を摂氏70度のウォーターバスに7分間入れることにより、細胞死を誘導します。細胞を染色するには、再構成した蛍光色素1マイクロリットルを1ミリリットルの細胞懸濁液を含むチューブ2および4にピペットで入れ、よく混合します。染色したチューブを光から保護して室温で30分間インキュベートします。次に、細胞を1ミリリットルのHBSSで2回洗浄し、最終ペレットを900マイクロリットルの同じバッファーに再懸濁します。次に、100マイクロリットルの37%ホルムアルデヒドをピペットでピペットで固定して細胞を固定し、室温で15分間インキュベートします。1%BSAを含む1ミリリットルのHBSSで細胞を2回洗浄した後、同じ溶液の1ミリリットルに再懸濁します。サンプルは摂氏4度で冷蔵庫で最大1か月間保管してください。固定サンプルチューブをフローサイトメーターのサンプルポートに入れて分析します。一重項ゲート内のサンプルごとに最低10,000のイベントを記録します。すべてのデータを保存し、外付けドライブまたはクラウドストレージにバックアップします。 前方散乱領域と側方散乱領域をプロットしてフローサイトメトリーデータを視覚化し、細胞サイズと粒度を評価します。シングルレットセルゲーティングを実行し、前方散乱領域と前方散乱高さをプロットすることにより、多重項を除外します。前方散乱プロファイルと横方散乱プロファイルに基づいて3つの白血球集団を特定します。生細胞と死細胞を区別するために、対応する蛍光チャネルでの生存率色素染色のしきい値を設定します。最適な条件下では、リンパ球、単球、顆粒球がそれぞれ白血球集団の31%、38%、31%を占めていましたが、熱ストレス下では、リンパ球は21.3%に減少し、単球は45.6%に増加し、顆粒球は33.1%で安定しました。最適な条件に曝露されたサンプルは、すべての白血球集団にわたって生細胞が優勢であり、より高い生存率を示しました。対照的に、熱ストレスを受けたサンプルは、細胞死の有意な増加を示しました。