Name: 単離された膵島治療とアポトーシス測定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-02T13:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: 学ぶ単離膵島の細胞死メカニズムとアポトーシス測定法。マウス膵島を用いた蛍光多染色と共焦点顕微鏡技術で、サイトカイン誘導β細胞死の時空間変化を解析し、1型糖尿病治療開発への知見を得る。

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<ol><li>Da Silva Xavier, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cells+of+the+islets+of+Langerhans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clinical+medicine%22%5BJournal%5D)">The cells of the islets of Langerhans.</a> J Clinical medicine. 7 (3), 54(2018).</li>
<li>Grunnet, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proinflammatory+cytokines+activate+the+intrinsic+apoptotic+pathway+in+%CE%B2-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Proinflammatory cytokines activate the intrinsic apoptotic pathway in β-cells.</a> Diabetes. 58 (8), 1807-1815 (2009).</li>
<li>Delaney, C. A., Pavlovic, D., Hoorens, A., Pipeleers, D. G., Eizirik, D. cL. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokines+induce+deoxyribonucleic+acid+strand+breaks+and+apoptosis+in+human+pancreatic+islet+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Cytokines induce deoxyribonucleic acid strand breaks and apoptosis in human pancreatic islet cells.</a> Endocrinology. 138 (6), 2610-2614 (1997).</li>
<li>Farnsworth, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+gap+junction+coupling+within+the+islet+of+langerhans+during+the+development+of+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">Modulation of gap junction coupling within the islet of langerhans during the development of type 1 diabetes.</a> Front Physiol. 13, 913611(2022).</li>
<li>Collins, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+protein+kinase+c+%CE%B4+by+caspase-3+mediates+proinflammatory+cytokine-induced+apoptosis+in+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Cleavage of protein kinase c δ by caspase-3 mediates proinflammatory cytokine-induced apoptosis in pancreatic islets.</a> J Biol Chem. 300 (9), 107611(2024).</li>
<li>Farnsworth, N. L., Walter, R., Piscopio, R. A., Schleicher, W. E., Benninger, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exendin-4+overcomes+cytokine-induced+decreases+in+gap+junction+coupling+via+protein+kinase+A+and+Epac2+in+mouse+and+human+islets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Exendin-4 overcomes cytokine-induced decreases in gap junction coupling via protein kinase A and Epac2 in mouse and human islets.</a> J Physiol. 597 (2), 431-447 (2019).</li>
<li>NIH CIT Consortium Chemistry Manufacturing Controls Monitoring Committee. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purified+human+pancreatic+islet-viability+estimation+of+islet+using+fluorescent+dyes+%28FDA%2FPI%29%3A+Standard+operating+procedure+of+the+NIH+clinical+islet+transplantation+consortium%5BTitle%5D)+AND+%22CellR4+Repair+Replace+Regen+Reprogram%22%5BJournal%5D)">Purified human pancreatic islet-viability estimation of islet using fluorescent dyes (FDA/PI): Standard operating procedure of the NIH clinical islet transplantation consortium.</a> CellR4 Repair Replace Regen Reprogram. 3 (1), e1378(2015).</li>
<li>Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutellingsperger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+assay+for+apoptosis+flow+cytometric+detection+of+phosphatidylserine+expression+on+early+apoptotic+cells+using+fluorescein+labelled+annexin+V%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Meth%22%5BJournal%5D)">A novel assay for apoptosis flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled annexin V.</a> J Immunol Meth. 184 (1), 39-51 (1995).</li>
<li>Rieger, A. M., Nelson, K. L., Konowalchuk, J. D., Barreda, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+annexin+V%2Fpropidium+iodide+apoptosis+assay+for+accurate+assessment+of+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Modified annexin V/propidium iodide apoptosis assay for accurate assessment of cell death.</a> J Vis Exp. (50), e2597(2011).</li>
<li>Emdin, S., Dodson, G., Cutfield, J., Cutfield, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+zinc+in+insulin+biosynthesis%3A+some+possible+zinc-insulin+interactions+in+the+pancreatic+B-cell%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Role of zinc in insulin biosynthesis: some possible zinc-insulin interactions in the pancreatic B-cell.</a> Diabetologia. 19, 174-182 (1980).</li>
<li>ZA, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+of+staining+fresh+and+cultured+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">A simple method of staining fresh and cultured islets.</a> Transplantation. 45 (4), 827-830 (1988).</li>
<li>Zalewski, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Video+image+analysis+of+labile+zinc+in+viable+pancreatic+islet+cells+using+a+specific+fluorescent+probe+for+zinc%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Video image analysis of labile zinc in viable pancreatic islet cells using a specific fluorescent probe for zinc.</a> J Histochem Cytochem. 42 (7), 877-884 (1994).</li>
<li>Jindal, R. M., Taylor, R. P., Gray, D. W., Esmeraldo, R., Morris, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+quantification+of+islets+by+measurement+of+zinc+content%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">A new method for quantification of islets by measurement of zinc content.</a> Diabetes. 41 (9), 1056-1062 (1992).</li>
<li>Jayaraman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+the+detection+of+viable+human+pancreatic+beta+cells+by+flow+cytometry+using+fluorophores+that+selectively+detect+labile+zinc%2C+mitochondrial+membrane+potential+and+protein+thiols%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">A novel method for the detection of viable human pancreatic beta cells by flow cytometry using fluorophores that selectively detect labile zinc, mitochondrial membrane potential and protein thiols.</a> Cytometry A. 73 (7), 615-625 (2008).</li>
<li>Lukowiak, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+purification+of+functional+human+%CE%B2-cells+by+a+new+specific+zinc-fluorescent+probe%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Identification and purification of functional human β-cells by a new specific zinc-fluorescent probe.</a> J Histochem Cytochem. 49 (4), 519-527 (2001).</li>
<li>Gee, K. R., Zhou, Z. L., Qian, W. J., Kennedy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+imaging+of+zinc+secretion+from+pancreatic+%CE%B2-cells+using+a+new+fluorescent+zinc+indicator%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Detection and imaging of zinc secretion from pancreatic β-cells using a new fluorescent zinc indicator.</a> J Am Chem Soc. 124 (5), 776-778 (2002).</li>
<li>Gyulkhandanyan, A. V., Lee, S. C., Bikopoulos, G., Dai, F., Wheeler, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Zn2%2B-transporting+pathways+in+pancreatic+%CE%B2-cells%3A+a+role+for+the+L-type+voltage-gated+Ca2%2B+channel%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The Zn2+-transporting pathways in pancreatic β-cells: a role for the L-type voltage-gated Ca2+ channel.</a> J Biol Chem. 281 (14), 9361-9372 (2006).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+murine+pancreatic+islet+cell-based+screening+for+diabetogenic+environmental+chemicals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A murine pancreatic islet cell-based screening for diabetogenic environmental chemicals.</a> J Vis Exp. (136), e57327(2018).</li>
<li>Farnsworth, N. L., Walter, R. L., Hemmati, A., Westacott, M. J., Benninger, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+level+pro-inflammatory+cytokines+decrease+connexin36+gap+junction+coupling+in+mouse+and+human+islets+through+nitric+oxide-mediated+protein+kinase+C%CE%B4%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Low level pro-inflammatory cytokines decrease connexin36 gap junction coupling in mouse and human islets through nitric oxide-mediated protein kinase Cδ.</a> J Biol Chem. 291 (7), 3184-3196 (2016).</li>
<li>Dalle, S., Abderrahmani, A., Renard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+inhibitors+of+%CE%B2-cell+dysfunction+and+death+as+therapeutics+for+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Pharmacological inhibitors of β-cell dysfunction and death as therapeutics for diabetes.</a> Front Endocrinol. 14, 1076343(2023).</li>
<li>Collins, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide-coated+polycaprolactone-Benzalkonium+chloride+nanocapsules+for+targeted+drug+delivery+to+the+pancreatic+%CE%B2-Cell%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl+Bio+Mater%22%5BJournal%5D)">Peptide-coated polycaprolactone-Benzalkonium chloride nanocapsules for targeted drug delivery to the pancreatic β-Cell.</a> ACS Appl Bio Mater. 7 (10), 6451-6466 (2024).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>14 mmガラス底ペトリ皿</td><td>Mattek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>1640 RPMI</td><td>Corning</td><td>10-041-CV</td><td></td></tr><tr><td>35 mmペトリ皿 Celltreat</td><td></td><td></td> 229638 <td></td></tr><tr><td>7 mmガラス底ペトリ皿</td><td>Mattek</td><td>P35G-1.5-7-C</td><td></td></tr><tr><td>アネキシン V、アレクサフラワー 488</td><td>サーモフィッシャー (Invitrogen)</td><td>A13201</td><td>ex488/em515</td></tr><tr><td>塩化カルシウム二水和物</td><td>フィッシャー</td><td>C79</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド無水</td><td>シグマ</td><td>276855</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>サーモフィッシャー (Gibco)</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>フルジン-3、AM</td><td>サーモフィッシャー (Invitrogen)</td><td>F24195</td><td>ex488/em516</td></tr><tr><td>フルオレセインジアセテート (FDA)</td><td>サーモフィッシャー (Invitrogen)</td><td>F1303</td><td>ex488/em520</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>54457</td><td></td></tr><tr><td>画像処理ソフトウェア</td><td>NIH</td><td>ImageJ</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシ</td>ウム <td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>NucBlue Live ReadyProbes 試薬 (Hoechst 33342)</td><td>Thermo Fisher (Invitrogen)</td><td>R37605</td><td>ex360/em460</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>Thermo Fisher (Gibco)</td><td>15-140-122&nbsp;</td><td></td></tr>リン<tr><td>酸緩衝生理食塩水錠</td><td>Fisher</td><td>BP2944-100</td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム、粒状</td><td>Macron</td><td>6858-04</td><td></td></tr><tr><td>ヨウ化プロピジウム</td><td>Thermo Fisher (Invitrogen)</td><td>P1304MP</td><td>ex535/em620</td></tr><tr><td>タンパク質組換えマウス IFN-γ タンパク質</td><td>R&D Systems</td><td>485-MI-100/CF</td><td></td></tr><tr><td>組換えマウス IL-1 ベータ/IL-1F2&nbsp;</td><td>R&D Systems</td><td>401-ML-100/CF</td><td></td></tr><tr><td>組換えマウス TNF-α (aa 80-235) タンパク質</td><td>R&D Systems</td><td>410-MT-100/CF</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム、クリスタル</td><td>マクロン</td><td>7581-12</td><td></td></tr><tr><td>スペクトル検出器付きステラリス共焦点マイクロコープ</td><td>ライカ</td><td>DMI-8</td><td>&nbsp;40倍の水浸対物レンズ。</td></tr><tr><td>Yopro-1ヨウ化物</td><td>サーモフィッシャー(Invitrogen)</td><td>Y3603</td><td>ex488 / em509</td></tr></tbody></table>

単離された膵島治療とアポトーシス測定

Isolated Pancreatic Islet Treatment and Apoptosis Measurement

FDAとPIによる二重染色は、サイトカインで処理された膵島の生存率を評価するために使用されました。すべての実験はトリプリケート(n = 3)で実施され、データは10 μm離れた複数のzスタック画像から生成され、各反復には5つまたは6つの島からの平均データが含まれていました。 図1A は、酵素活性細胞によるFDAのフルオレセインへの変換により、未処理の対照群からの健康な膵島が明確な緑色蛍光を示すことを示しています。赤色蛍光が存在しないか、またはほとんど存在しないことは、これらの膵島の生存率を確認し、無傷の細胞膜を示しています。対照的に、 図1B は、サイトカイン処理された膵島で有意な赤色蛍光を示し、死んだ細胞または死にかけている細胞に膜の完全性が損なわれていることを示しています。この赤色蛍光の増加は、膜破壊を伴う非生存細胞の核のPI染色を浮き彫りにしています。サイトカイン濃度が膵島の生存率に与える影響を 図1Cに示します。定量的データは、膵島の死亡率とサイトカイ...

This study investigates the effect of pro-inflammatory cytokines on pancreatic islets, particularly insulin-producing &#946;-cells, using a combination of ...

isolated-pancreatic-islet-treatment-and-apoptosis-measurement

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

ヒト膵島の高品質と適切な量を達成することが成功した膵島移植のための著名な前提条件の一つです。修正された自動化された方法を使用して：このビデオでは、我々は人間の膵島の分離（ヒト膵島の精製と​​文化部II）の手順をステップバイステップで説明します。...

人間の膵島単離：パートII：ヒト膵島の精製と​​文化

研究のための2型糖尿病膵島の供給が不十分です。ここでは、膵部分切除を受けた患者からの膵島を単離するための我々のプロトコルを共有しています。このアプローチは、2型糖尿病と基礎および臨床研究のための十分な数の臨床的にマッチした非糖尿病患者からの膵島を得るためのユニークな会場を表します。...

部分的に膵臓を摘出された患者からのヒト膵島の単離

膵島は、ランゲルハンス島とも呼ばれ、グルコース調節やその他の重要な生物学的機能のためのホルモンを産生する内分泌細胞のクラスターです。このプロトコルでは、最初にAmpulla of...

コラゲナーゼ灌流による膵島単離:膵島細胞を単離するための酵素的方法

ランゲルハンス単離したマウスの膵島を用いたin vitroβ細胞機能をアッセイすることは、糖尿病の病態と治療薬の研究に重要な要素である。多くの下流のアプリケーションが利用可能であるが、このプロトコルは、具体的にはβ細胞機能を決定する本質的なパラメータとして、細胞内サイクリックアデノシン一リン酸（cAMP）の測定を記載する。...

マウス膵島の単離と細胞内cAMP測定法

糖尿病研究分野のための重要な課題は、膵島β細胞の複製を調節する分子機構を理解し、β細胞の再生を刺激するための方法を開発することです。本明細書中の小分子のβ細胞の複製を促進する活性を同定および評価するためのハイコンテントスクリーニング方法が提供されます。...

ハイコンテンツ<em&gt;インビトロ</em&gt;膵島β細胞の複製ディスカバリー・プラットフォーム

このプロトコルは、一次ヒト化物試料からベータ細胞に特異的にミトファジータンパク質複合体形成の定量分析のための方法を概説する。この技術により、貴重なヒト膵臓ベータ細胞サンプルにおいて重要な限られた生物材料からのミトファジーの分析が可能になります。...

近接リゲーションアッセイを利用したヒト膵臓ベータ細胞における内因性ミトファジー複合体の可視化

ここでは、液滴ベースのマイクロ流体単一細胞RNAシーケンシング技術を用いて、単体ヒト膵島から単一細胞の高品質で大規模なトランスクリプトームデータを生成するプロトコルを提示する。...

ヒト膵島の単一細胞RNAシーケンシングと解析

このプロトコルは、膵島の分離と精製のためのブタ膵臓の調達に関するステップバイステップのガイドを提供します。...

膵島隔離のためのブタ膵臓の外科的灌流と隔離

ここでは、交絡因子の可能性を減らしながら内分泌膵臓機能を評価するための追加技術として、無傷の膵臓を持つマウス血管系を通る灌流を介してグルコース刺激インスリン分泌 (GSIS)...

無傷の膵臓を持つマウス血管系を介した灌流によるグルコース刺激インスリン分泌

このプロトコルは、ルイスラット膵島の外科的収穫、酵素的消化、密度勾配精製のための標準化された方法を説明し、移植や in vitro...

酵素による消化および密度-勾配分離を用いたルイスラットからの膵島の分離と精製

学ぶ単離膵島の細胞死メカニズムとアポトーシス測定法。マウス膵島を用いた蛍光多染色と共焦点顕微鏡技術で、サイトカイン誘導β細胞死の時空間変化を解析し、1型糖尿病治療開発への知見を得る。

単離された膵島治療とアポトーシス測定

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