U2 OS細胞培養を用いた生細胞、蛍光顕微鏡法のためのエレクトロポレーションサイトメトリープロトリー

この研究の範囲は、パルス電場が細胞の挙動に及ぼす影響、特にエレクトロポレーションが細胞周期にどのように影響するかに焦点を当てています。

このプロトコルの主な利点は、哺乳類細胞培養を使用して最大72時間連続的な生細胞エレクトロポレーション実験を実行できることです。私たちの研究室は、これらの技術をマイクロ流体工学に適応させることに重点を置いており、これによりサンプルサイズの縮小、試薬要件の削減、将来のプロトコルでのサンプル管理の改善が可能になります。

[ナレーター]まず、10%FBSと1%ペニシリンストレプトマイシンを含む10ミリリットルのDMEM高グルコースを含む10センチメートルのプレートでU2OS FUCCI CA5細胞を培養します。プレートを摂氏37度で5%の二酸化炭素環境でインキュベートします。培養物が80%のコンフルエンスに達したら、プレートから培地を吸引します。細胞をPBSで洗浄し、1ミリリットルの0.25%トリプシンを加え、1.5分間インキュベートして細胞を解離させます。解離した細胞を5ミリリットルのDMEM高グルコースに再懸濁することにより、トリプシンを中和します。再懸濁培養物から100マイクロリットルのサンプルを採取し、エレクトロポレーションサイトメトリーシステムチャンバー内の下部ガラスカバースリップに置きます。サンプルを導入した後、チャンバーが30%コンフルエントであることを確認してください。4ミリリットルのDMEM高グルコースをチャンバーの遠端にゆっくりと加え、液体がサンプルを洗い流すのを防ぎます。標準的な顕微鏡スライドをチャンバーの上に置き、チャンバーを摂氏37度、二酸化炭素5%で24時間インキュベートします。環境制御チャンバーを備えた倒立蛍光顕微鏡の電源を入れて、エレクトロポレーションの前にシステムを安定させます。環境チャンバーが安定している間に、ワニ口クリップケーブルを使用してデジタルマルチメーターをパルス発生器コンデンサと高電圧スイッチに接続し、エレクトロポレーションチャンバーを迅速にセットアップします。次に、顕微鏡で20倍の倍率を選択します。顕微鏡ソフトウェアで、FUCCI CA5システム内の2つの蛍光タンパク質に対応するFITC/GFPおよびA594 Texas Red M Cherryチャネルが選択されていることを確認します。長時間のイメージング中の写真の損傷を防ぐために、通常は 0.05 秒未満の低露出設定を使用します。タイムラプスイメージングを開始する前に、テスト画像を撮影して画像の焦点と品質を最適化します。24時間にわたって10分ごとに3〜6つの異なる視点から画像をキャプチャするようにタイムラプスをプログラムし、写真の損傷を軽減しながらタイムラプスごとに大量の細胞周期データを取得します。タイムラプス中のカルチャの追跡を最適化するために、A594チャネルでオートフォーカスが有効になっていることを確認します。エレクトロポレーションが完了するまで、ソフトウェアを開いたままにしてください。エレクトロポレーションサイトメトリーチャンバーを、適切な環境チャンバーを備えた顕微鏡に入れます。エレクトロポレーションの前に、チャンバーを閉じたままにし、適切な細胞周期状態を維持するために環境システムが稼働し続けることを確認します。環境チャンバーを開き、デジタルマルチメーターをパルス発生器に取り付け、ワニ口クリップケーブルを使用してパルス発生器をチャンバー電極に接続します。パルス発生器コンデンサを180ボルトに充電します。デジタルマルチメーターがゼロボルトを表示するまで、パルスをチャンバーに急速に放電します。チャンバーからすべての電気接続を取り外し、チャンバーの蓋を直ちに交換して、最適な培養条件を確保します。環境チャンバーが所定の位置にしっかりと設置されたら、すぐにタイムラプスイメージングを起動します。タイムラプスが完了したら、顕微鏡ソフトウェアを使用して、キャプチャしたすべての画像を 1 つのビデオとして保存します。視覚的な品質を調整して、手動定量用の細胞特徴の明瞭さを高めます。最後に、時間の経過に伴うFITCおよびA594信号の変化を観察して、タイムラプスビデオで細胞相を追跡します。Fujiシステムを使用して、タンパク質の発現とユビキチン化に関連する色の変化を追跡して視覚データを収集し、G1、S、G2、M相を明確に区別できるようにしました。これにより、さまざまな条件下での細胞周期の進行を直接観察できるようになりました。この図は、非同期細胞培養とS相同期細胞培養を使用した2セットの実験から収集された主要なデータの概要を示しています。同期していないセルでのパルス電界曝露は、G1、G2、およびM相の平均長を大幅に増加させましたが、S相は変化しませんでした。 同期細胞では、パルス電界曝露によりG1、S、およびG2相の持続時間が短縮されましたが、SとG2のみが統計的に有意であり、M相は影響を受けませんでした。