U2 OS細胞培養を用いた生細胞、蛍光顕微鏡法のためのエレクトロポレーションサイトメトリープロトリー
2025年6月13日
エレクトロポレーションとは、パルス電界(PEF)を使用して細胞培養に一過性の細孔を作り、分子カーゴを導入することです。この技術は、最近、研究や臨床現場で広く使用されるようになりました。ここでは、最近開発された「エレクトロポレーションサイトメトリーシステム」を用いた、生細胞の蛍光顕微鏡法を用いたエレクトロポレーション技術について述べます。
この研究の範囲は、パルス電場が細胞の挙動に及ぼす影響、特にエレクトロポレーションが細胞周期にどのように影響するかに焦点を当てています。
このプロトコルの主な利点は、哺乳類細胞培養を使用して最大72時間連続的な生細胞エレクトロポレーション実験を実行できることです。私たちの研究室は、これらの技術をマイクロ流体工学に適応させることに重点を置いており、これによりサンプルサイズの縮小、試薬要件の削減、将来のプロトコルでのサンプル管理の改善が可能になります。
[ナレーター]まず、10%FBSと1%ペニシリンストレプトマイシンを含む10ミリリットルのDMEM高グルコースを含む10センチメートルのプレートでU2OS FUCCI CA5細胞を培養します。プレートを摂氏37度で5%の二酸化炭素環境でインキュベートします。培養物が80%のコンフルエンスに達したら、プレートから培地を吸引します。細胞をPBSで洗浄し、1ミリリットルの0.25%トリプシンを加え、1.5分間インキュベートして細胞を解離させます。解離した細胞を5ミリリットルのDMEM高グルコースに再懸濁することにより、トリプシンを中和します。再懸濁培養物から100マイクロリットルのサンプルを採取し、エレクトロポレーションサイトメトリーシステムチャンバー内の下部ガラスカバースリップに置きます。サンプルを導入した後、チャンバーが30%コンフルエントであることを確認してください。4ミリリットルのDMEM高グルコースをチャンバーの遠端にゆっくりと加え、液体がサンプルを洗い流すのを防ぎます。標準的な顕微鏡スライドをチャンバーの上に置き、チャンバーを摂氏37度、二酸化炭素5%で24時間インキュベートします。環境制御チャンバーを備えた倒立蛍光顕微鏡の電源を入れて、エレクトロポレーションの前にシステムを安定させます。環境チャンバーが安定している間に、ワニ口クリップケーブルを使用してデジタルマルチメーターをパルス発生器コンデンサと高電圧スイッチに接続し、エレクトロポレーションチャンバーを迅速にセットアップします。次に、顕微鏡で20倍の倍率を選択します。顕微鏡ソフトウェアで、FUCCI CA5システム内の2つの蛍光タンパク質に対応するFITC/GFPおよびA594 Texas Red M Cherryチャネルが選択されていることを確認します。長時間のイメージング中の写真の損傷を防ぐために、通常は 0.05 秒未満の低露出設定を使用します。タイムラプスイメージングを開始する前に、テスト画像を撮影して画像の焦点と品質を最適化します。24時間にわたって10分ごとに3〜6つの異なる視点から画像をキャプチャするようにタイムラプスをプログラムし、写真の損傷を軽減しながらタイムラプスごとに大量の細胞周期データを取得します。タイムラプス中のカルチャの追跡を最適化するために、A594チャネルでオートフォーカスが有効になっていることを確認します。エレクトロポレーションが完了するまで、ソフトウェアを開いたままにしてください。エレクトロポレーションサイトメトリーチャンバーを、適切な環境チャンバーを備えた顕微鏡に入れます。エレクトロポレーションの前に、チャンバーを閉じたままにし、適切な細胞周期状態を維持するために環境システムが稼働し続けることを確認します。環境チャンバーを開き、デジタルマルチメーターをパルス発生器に取り付け、ワニ口クリップケーブルを使用してパルス発生器をチャンバー電極に接続します。パルス発生器コンデンサを180ボルトに充電します。デジタルマルチメーターがゼロボルトを表示するまで、パルスをチャンバーに急速に放電します。チャンバーからすべての電気接続を取り外し、チャンバーの蓋を直ちに交換して、最適な培養条件を確保します。環境チャンバーが所定の位置にしっかりと設置されたら、すぐにタイムラプスイメージングを起動します。タイムラプスが完了したら、顕微鏡ソフトウェアを使用して、キャプチャしたすべての画像を 1 つのビデオとして保存します。視覚的な品質を調整して、手動定量用の細胞特徴の明瞭さを高めます。最後に、時間の経過に伴うFITCおよびA594信号の変化を観察して、タイムラプスビデオで細胞相を追跡します。Fujiシステムを使用して、タンパク質の発現とユビキチン化に関連する色の変化を追跡して視覚データを収集し、G1、S、G2、M相を明確に区別できるようにしました。これにより、さまざまな条件下での細胞周期の進行を直接観察できるようになりました。この図は、非同期細胞培養とS相同期細胞培養を使用した2セットの実験から収集された主要なデータの概要を示しています。同期していないセルでのパルス電界曝露は、G1、G2、およびM相の平均長を大幅に増加させましたが、S相は変化しませんでした。 同期細胞では、パルス電界曝露によりG1、S、およびG2相の持続時間が短縮されましたが、SとG2のみが統計的に有意であり、M相は影響を受けませんでした。
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概要
この記事では、分子貨物の導入のために細胞培養に一時的な細孔を作り出すパルス電界を利用する技術である電気穿孔について説明します。ライブ細胞蛍光顕微鏡観察のために「電気穿孔サイトメトリーシステム」の使用に焦点を当てています。
研究の主要構成要素
科学の分野
- 細胞生物学
- 電気生理学
- ライブ細胞イメージング
背景
- 電気穿孔は研究および臨床応用で広く使用されています。
- 細胞に様々な分子を導入することができます。
- この技術はマイクロ流体工学に適応させることができます。
- 最大72時間の継続的なライブ細胞実験が可能です。
研究の目的
- パルス電界が細胞の挙動に与える影響を探求すること。
- 電気穿孔が細胞周期にどのように影響するかを調査すること。
- サンプル制御を改善するために電気穿孔技術を適応させること。
使用した方法
- 電気穿孔サイトメトリーシステムの利用。
- ライブ細胞蛍光顕微鏡技術。
- 哺乳類細胞培養へのパルス電界の適用。
- サンプルサイズを減少させるためのマイクロ流体工学の適応。
主な結果
- 継続的なライブ細胞電気穿孔の実現可能性を示しました。
- 電気穿孔が細胞周期のダイナミクスに与える影響を示しました。
- マイクロ流体工学の適用の利点を強調しました。
- 将来の実験プロトコルのための洞察を提供しました。
結論
- 電気穿孔は細胞培養における分子導入のための価値あるツールです。
- この技術で細胞の挙動の継続的なモニタリングが可能です。
- 将来の適応により実験の効率と制御が向上する可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Electroporation cytometry enables real-time, quantitative analysis of live-cell responses to pulsed electric fields, supporting mechanistic de-risking and target validation in early discovery. The protocol's integration with fluorescence microscopy and cell cycle reporters provides actionable insights into cell phase dynamics under experimental perturbation. This capability strengthens predictive confidence at key inflection points in the discovery pipeline.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of cell cycle modulation by external stimuli for functional target validation.
- Supports mechanistic de-risking by quantifying phase-specific cellular responses to electroporation.
- Facilitates hypothesis-driven exploration of cell behavior under controlled perturbations.
Screening & Assay Development
- Provides a validated live-cell system for reproducible, quantitative fluorescence-based readouts.
- Enables standardized time-lapse imaging for high-content screening of cell cycle effects.
- Supports assay scalability and platform reuse through microfluidic adaptation potential.
Translational & Preclinical Research
- Aligns cell cycle phase quantification with disease-relevant models for translational continuity.
- Enables risk-adjusted advancement decisions by linking mechanistic insights to phenotypic outcomes.
- Supports biomarker development through real-time tracking of cell cycle transitions.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol bridges early discovery and preclinical workflows by enabling continuous, quantitative monitoring of live-cell responses to pulsed electric fields.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying cell cycle phase changes post-electroporation.
- Screening: Delivers reproducible, high-content fluorescence data for comparative analysis across experimental conditions.
- Analytics: Provides quantitative phase duration measurements for robust statistical evaluation.
- Translational Research: Facilitates alignment of in vitro findings with disease-relevant cellular behaviors.
- Enterprise Reuse: Offers a modular platform adaptable to diverse cell types and experimental designs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cell-based assays.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of live-cell experimentation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by providing actionable, quantitative data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of discovery-stage assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in live-cell imaging, fluorescence microscopy, and electroporation techniques.
- Demands access to environmental control chambers and high-resolution imaging platforms.
- Necessitates cross-team standardization of imaging parameters and data analysis workflows.
- Adaptable to microfluidic systems for reduced sample and reagent consumption.
- Dependent on robust statistical analysis to interpret phase-specific cell cycle changes.
