Name: 神経変性疾患の治療における再プログラム幹細胞由来前駆細胞における化学遺伝学的制御 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: 学ぶ化学的再プログラム幹細胞由来ドーパミン作動性前駆細胞の移植法。マウスパーキンソン病モデルで電気生理学的モニタリングと行動評価により神経活動の機能的回復を評価する革新的細胞治療アプローチです。

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<ol><li>Thiel, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aThiel%2C+G+%22Designer+receptors+exclusively+activated+by+designer+drugs%22">Designer receptors exclusively activated by designer drugs</a>. , Humana Press. (2015).</li>
<li>Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dreadds+for+neuroscientists%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Dreadds for neuroscientists.</a> Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).</li>
<li>Gomez, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemogenetics+revealed%3A+DREADD+occupancy+and+activation+via+converted+clozapine%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Chemogenetics revealed: DREADD occupancy and activation via converted clozapine.</a> Science. 357 (6350), 503-507 (2017).</li>
<li>Chehelgerdi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+promising+potential+of+induced+pluripotent+stem+cells+in+cancer+research+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer%22%5BJournal%5D)">Exploring the promising potential of induced pluripotent stem cells in cancer research and therapy.</a> Mol Cancer. 22 (1), 189(2023).</li>
<li>Song, J., Patel, R. V., Sharif, M., Ashokan, A., Michaelides, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemogenetics+as+a+neuromodulatory+approach+to+treating+neuropsychiatric+diseases+and+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Chemogenetics as a neuromodulatory approach to treating neuropsychiatric diseases and disorders.</a> Mol Ther. 30 (3), 990-1005 (2022).</li>
<li>Parmar, M., Grealish, S., Henchcliffe, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+future+of+stem+cell+therapies+for+Parkinson+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The future of stem cell therapies for Parkinson disease.</a> Nat Rev Neurosci. 21 (2), 103-115 (2020).</li>
<li>Dell'anno, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remote+control+of+induced+dopaminergic+neurons+in+Parkinsonian+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Remote control of induced dopaminergic neurons in Parkinsonian rats.</a> J Clin Invest. 124 (7), 3215-3229 (2014).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+control+of+grafted+human+PSC-derived+neurons+in+a+mouse+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Chemical control of grafted human PSC-derived neurons in a mouse model of Parkinson's disease.</a> Cell Stem Cell. 18 (6), 817-826 (2016).</li>
<li>Bjorklund, A., Parmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+cell+therapy%3A+From+cell+replacement+to+circuitry+repair%5BTitle%5D)+AND+%22J+Parkinsons+Dis%22%5BJournal%5D)">Dopamine cell therapy: From cell replacement to circuitry repair.</a> J Parkinsons Dis. 11 (S2), S159-S165 (2021).</li>
<li>Alcacer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemogenetic+stimulation+of+striatal+projection+neurons+modulates+responses+to+Parkinson%27s+disease+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Chemogenetic stimulation of striatal projection neurons modulates responses to Parkinson's disease therapy.</a> J Clin Invest. 127 (2), 720-734 (2017).</li>
<li>Alexander, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remote+control+of+neuronal+activity+in+transgenic+mice+expressing+evolved+G+protein-coupled+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Remote control of neuronal activity in transgenic mice expressing evolved G protein-coupled receptors.</a> Neuron. 63 (1), 27-39 (2009).</li>
<li>Stachniak, T. J., Ghosh, A., Sternson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemogenetic+synaptic+silencing+of+neural+circuits+localizes+a+hypothalamus+midbrain+pathway+for+feeding+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Chemogenetic synaptic silencing of neural circuits localizes a hypothalamus midbrain pathway for feeding behavior.</a> Neuron. 82 (4), 797-808 (2014).</li>
<li>Kang, H. J., Minamimoto, T., Wess, J., Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemogenetics+for+cell-type-specific+modulation+of+signalling+and+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Methods+Primers%22%5BJournal%5D)">Chemogenetics for cell-type-specific modulation of signalling and neuronal activity.</a> Nat Rev Methods Primers. 3 (1), 93(2023).</li>
<li>Miyanishi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+tests+predicting+striatal+dopamine+level+in+a+rat+hemi-Parkinson%27s+disease+model%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochem+Int%22%5BJournal%5D)">Behavioral tests predicting striatal dopamine level in a rat hemi-Parkinson's disease model.</a> Neurochem Int. 122, 38-46 (2019).</li>
<li>Zheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+IPSC-derived+midbrain+organoids+functionally+integrate+into+striatum+circuits+and+restore+motor+function+in+a+mouse+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Human IPSC-derived midbrain organoids functionally integrate into striatum circuits and restore motor function in a mouse model of Parkinson's disease.</a> Theranostics. 13 (8), 2673-2692 (2023).</li>
<li>Xiong, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+stem+cell-derived+neurons+repair+circuits+and+restore+neural+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Human stem cell-derived neurons repair circuits and restore neural function.</a> Cell Stem Cell. 28 (1), 112-126.e6 (2021).</li>
<li>Yuan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopaminergic+precursors+differentiated+from+human+blood-derived+induced+neural+stem+cells+improve+symptoms+of+a+mouse+Parkinson%27s+disease+model%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Dopaminergic precursors differentiated from human blood-derived induced neural stem cells improve symptoms of a mouse Parkinson's disease model.</a> Theranostics. 8 (17), 4679(2018).</li>
<li>Zhu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+acute+spinal+cord+slices+for+whole-cell+patch-clamp+recording+in+substantia+gelatinosa+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of acute spinal cord slices for whole-cell patch-clamp recording in substantia gelatinosa neurons.</a> J Vis Exp. (143), (2019).</li>
<li>Wang, X., Han, D., Zheng, T., Ma, J., Chen, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+human+induced+neural+stem+cell-derived+dopaminergic+neurons+by+DREADD+reveals+therapeutic+effects+on+a+mouse+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Modulation of human induced neural stem cell-derived dopaminergic neurons by DREADD reveals therapeutic effects on a mouse model of Parkinson's disease.</a> Stem Cell Res Ther. 15 (1), 297(2024).</li>
<li>Iancu, R., Mohapel, P., Brundin, P., Paul, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+characterization+of+a+unilateral+6-OHDA-lesion+model+of+Parkinson%27s+disease+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Behav+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Behavioral characterization of a unilateral 6-OHDA-lesion model of Parkinson's disease in mice.</a> Behav Brain Res. 162 (1), 1-10 (2005).</li>
<li>Surmeier, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+dopamine+in+modulating+the+structure+and+function+of+striatal+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">The role of dopamine in modulating the structure and function of striatal circuits.</a> Prog Brain Res. 183, 148-167 (2010).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>2 x Rapid Taq Master Mix</td><td>Vazyme</td><td>P222-01</td> ジェ<td>ノタイピング分析に</td></tr><tr><td>2 回使用。シームレスクローニングミックス</td>バイオ<td>メッド遺伝子技術</td><td>プラスミド構築に使用される</td><td>CL117-01</td></tr><tr>PD<td>マウスモデルの確立に使用される</td><td>6-OHDA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4381</td></tr> コントロール<tr>として使用される<td>AAVS1-Pur-CAG-EGFP</td><td>Addgene</td><td>80945</td>&<td>nbsp。</td></tr><tr><td>AAVS1-Pur-CAG-hM4Di-mCherry</td><td>Addgene</td><td>80947</td><td>hM4Di-T2A-ZsGreen の構築のためのオリジナルプラスミド</td></tr><tr><td>AAVS1-Pur-CAG-hM3Dq-mCherry</td><td>Addgene</td><td>80948</td><td>hM3Dq-T2A-ZsGreen の構築のためのオリジナルプラスミド</td></tr><tr><td>AAVS1-CAG-hM4Di-T2A-ZsGreen</td><td>N/A</td><td>N/A</td> #<td>80947</td></tr><tr><td>AAVS1-CAG-hM3Dq-T2A-ZsGreen</td><td>N/A</td> N<td>/A</td><td>#80948</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Invitrogen</td><td>A11105-01</td> 細胞<td>の消化に使用</td></tr><tr><td>AMAXA Nucleofector</td><td>Lonza</td><td>AAD-1001S</td><td></td></tr><tr><td>Apomorphine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4393</td><td></td></tr><tr><td>人工脳脊髄液 (ACSF)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>125 mM NaCl、2.5 mM KCl、2 mM CaCl2、1.25 mM NaH2PO4、1 mM MgSO4、25 mMグルコース、および&nbsp;26 mM NaHCO3</td></tr><tr><td>アスコルビン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1043003</td><td></td></tr><tr><td>B-27 サプリメント</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>BDNF</td><td>Peprotech</td><td>450-02</td><td></td></tr><tr><td>cAMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0627</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Yeasen</td><td>53003ES10</td><td></td></tr><tr><td>クロザピン-N-オキシド</td><td>エンツォ</td><td>BML-NS105</td><td></td></tr><tr><td>DAPT</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>D5942</td><td></td></tr><tr><td>デシプラミン&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>D3900</td><td></td></tr><tr><td>D-グルコース</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>ギブコ</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>ギブコ</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>FGF8</td><td>ペプロテック</td><td>100-25</td><td></td></tr><tr><td>GDNF</td><td>ペプロテック</td><td>450-10</td><td></td></tr><tr><td>グルタマックス</td><td>ギブコ</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>ハンクs 平衡塩溶液 (HBSS)</td><td>Gibco</td><td>14175095</td><td></td></tr><tr><td>ヒト白血病阻害因子 (hrLIF)</td><td>ミリポア</td><td>LIF1010</td><td></td></tr><tr><td>氷結細胞内液</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>130 mM K-グルコン酸塩、16 mM KCl、0.2 mM EGTA、2 mM MgCl2、10 mM HEPES、4 mM Na2-ATP、0.4 mM Na3-GTP、 0.3% ニューロビオチン</td></tr><tr><td>ノックアウト 血清 交換</td><td>Gibco</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>ラミニン</td><td>ロシュ</td><td>11243217001</td><td></td></tr><tr><td>マイクロピペット プーラー</td><td>サッター インスツルメント カンパニー</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>N-2 サプリメント</td><td>サーモ フィッシャー</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>ニューロベース A 培地</td><td>Gibco</td><td>10888-022</td><td></td></tr><tr><td>非必須アミノ酸 (NEAA)</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>pCLAMP 11 ソフトウェアスイート</td><td>Molecular Devices</td><td>N/A</td><td>パッチクランプ電気生理学データ取得および分析ソフトウェア</td></tr> フェーズ <tr><td>1 分化培地</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>96% DMEM/F12 (Gibco、11320-033)、1% B-27 サプリメント、1% N-2 サプリメント、1% NEAA、1% GlutaMax、1 &M SAG1、および100 ng / mL FGF8&nbsp;</td></tr>第<tr><td>2相分化培地&nbsp;</td><td>該当なし</td><td></td><td>96% DMEM/F12 (Gibco、11320-033)、1% B-27 サプリメント、1% N-2 サプリメント、1% NEAA、および 1% GlutaMax、10 ng/mL BDNF、10 ng/mL GDNF、1 ng/mL TGF-&III、10 & マイクロ;M DAPT、0.2 mMアスコルビン酸、および0.5 mM cAMP。</td></tr><tr><td>ポリ-D-臭化水素酸塩(PDL)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7886</td><td></td></tr><tr><td>ジェノタイピング用プライマー</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>挿入後:TCTTCACTCGCTGGGTTCCCTT; 挿入逆:CCTGTGGGAGGAGAGAAGAGGT; ホモ接合性フォワード:CGTCTCCCTGGCTTTAGCCA;ホモ接合性逆:GATCCTCTCTGGCTCCATCG</td></tr><tr><td>pX458</td><td>Addgene</td><td>152199</td><td></td></tr><tr><td>SAG1</td><td>Enzo</td><td>ALX-270-426-M01</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Yeasen</td><td>53004ES50</td><td></td></tr><tr><td>スクロースベースの人工脳脊髄液 (s-ACSF)234</td><td></td><td></td> <td>mM スクロース、2.5 mM KCl、26 mM NaHCO3、1.25 mM NaH2PO4、11 mM Dグルコース、0.5 mM CaCl2、および 10 mM MgSO4</td></tr><tr><td>幹細胞培養メディア</td><td>N/A N</td><td>/A</td><td>&NBSP;48% DMEM/F12 (Gibco、11330-032) および 48% Neurobasal、1% B27、1% N2、1% NEAA、1% GlutaMax、10 ng/mL hrLIF、2 &M SB431542、および 3 & micro;M</td></tr><tr><td>CHIR99021 TGF-&ベータ;III</td><td>Peprotech</td><td>100-36E</td><td></td></tr><tr><td>移植バッファー</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>HBSS バッファー、5 g/L D-グルコース、100 ng/mL BDNF、100 ng/mL GDNF、および 0.2 mM アスコルビン酸</td></tr><tr><td>ビブラトーム</td>を含む <td>Leica&nbsp;</td><td>VT1000 S</td><td></td></tr><tr><td>全細胞パッチクランプ</td>分子<td>デバイス</td><td>&nbsp;マルチクランプ700B</td><td></td></tr></tbody></table>

神経変性疾患の治療における再プログラム幹細胞由来前駆細胞における化学遺伝学的制御

Chemogenetic Regulation in Reprogrammed Stem Cell-derived Precursor Cells in Treating Neurodegenerative Diseases

図1 は、興奮性(hM3Dq)または抑制性(hM4Di)DREADD受容体を発現する人工ヒト再プログラム幹細胞に対するこの方法論的アプローチの主要なステップを示しており、パーキンソン病(PD)のマウスモデルにおいて、誘導されたドーパミン作動性前駆体の機能的統合と調節を評価しています。 図2 は、hM4Di-T2A-ZsGreenおよびhM3Dq-T2A-ZsGreenの非融合コンストラクトを再プログラムされた幹細胞に導入し、ジェノタイピングによって検証するためのCRISPR/Cas9を介した遺伝子ノックイン戦略の概要を示しています。
図3は、移植細胞における化学遺伝学的調節の機能的およびシナプス的効果を特徴付けています。私たちは、移植されたDREADD細胞の影響を分析するために、行動評価と電気生理学的記録を実施しました。図 3A は、生理食塩水、...

The integration of designer receptors exclusively activated by designer drugs (DREADD) with stem cell-based therapies presents an advanced strategy for ...

chemogenetic-regulation-reprogrammed-stem-cell-derived-precursor

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

皮質の神経形成：研究室の進歩からセルベースの​​治療への移行

このビデオは、遺伝子組み換え造血前駆細胞をニューロン幹細胞に直接再プログラミングする方法を示しています。造血前駆細胞によって発現される転写因子は、それらの形質転換を促進する分子イベントのカスケードを引き起こします。さらに特異的な培地を使用して、誘導されたニューロン幹細胞を選択し、増殖させます。...

造血前駆細胞の神経幹細胞への直接リプログラミング

出典: Sharma, AD, et.al.神経保護戦略のための治療因子の送達のために改変された成体幹細胞のハイスループット特性化J. Vis.

神経治療応用のための遺伝子組み換え間葉系幹細胞の特性評価

このプロトコルは、単一の細胞懸濁液に解離することなく、球状の神経幹細胞および前駆細胞集合体の拡大を可能にする新たな機械的なチョッピング方法が記載されている。細胞/細胞接触を維持することは、40以上の継代するための迅速かつ安定的な成長を可能にします。...

ヒト神経の集合体のためのcGMP適用可能な展開法は、幹細胞および前駆細胞は、多能性幹細胞や胎児の脳組織由来

この研究は、人工幹細胞とその振る舞いを迅速に特徴づけるための実験プラットフォームを、神経系の救助と修復のための長期の生体内移植研究に適用するためのものです。...

神経保護戦略のための治療因子の送達のために設計成体幹細胞の高スループット特性評価

人工多能性幹細胞の生成は、自家移植の導出のための魅力的な展望を提供しています。しかし、多能性状態と面倒な再分化の進行はまだ臨床の翻訳を妨げます。ここでは、成人のヒト線維芽細胞の誘導および誘導神経前駆細胞への直接変換と神経系統へその後の分化を説明します。...

成人ヒト線維芽細胞の導出と拡張神経前駆細胞へのそれらの直接変換

直接神経細胞リプログラミングと、開始の体細胞の年齢を維持するニューロンが生成されます。ここでは、大人の人間のドナーから得られる皮膚線維芽細胞から誘導される神経細胞を生成する単一ベクトル...

ひと成人皮膚線維芽細胞から誘導される神経細胞の高収率文化の生成の単純です

このプロトコルは、仙台ウイルス感染による神経幹細胞を誘導する末梢血単核細胞のリプログラミング、ドーパミン作動性ニューロンへのiNSCの分化、DA前駆体の一方的な病変への移植を提示するパーキンソン病マウスモデル、およびPD治療のためのiNSC由来DA前駆体の安全性および有効性の評価。...

末梢単核細胞からの誘導神経幹細胞の生成と移植研究におけるドーパミン作動性ニューロン前駆体への分化

我々は、再プログラム化された末梢血細胞から神経表現型を有する細胞を得るための遺伝子組換え非遺伝子組換え(GMフリー)法を提示する。新規ヒトGPI結合タンパク質にリンクされたシグナル伝達経路の活性化は、ヒト多能性幹細胞を得るための効率的なGMフリーの方法を明らかにする。...

血液由来神経細胞のGMフリー生成

ヒト皮膚由来線維芽細胞を誘発ニューロン前駆細胞(iNIC)に再プログラムするプロトコルと、その後の誘導アストロサイト(iA)への分化について説明する。この方法は、iNPCとiAを大量に高速かつ再現可能に生成します。...

線維芽細胞からニューロン前駆細胞への直接変換とアストロサイトへの分化を用いた神経疾患のインビトロモデリング

ニューロンプログラミングによって生成されたヒト多能性幹細胞由来のGABA作動性ニューロンの移植は、神経発達障害の潜在的な治療アプローチとなる可能性があります。このプロトコルは、ヒト幹細胞由来のGABA作動性ニューロン前駆体の生成と新生児マウスの脳への移植を記述しており、移植されたニューロンの長期的な調査とその治療可能性の評価を可能にします。...

ヒト幹細胞由来GABA作動性ニューロンの生後早期マウス海馬への移植による神経発達障害緩和

学ぶ化学的再プログラム幹細胞由来ドーパミン作動性前駆細胞の移植法。マウスパーキンソン病モデルで電気生理学的モニタリングと行動評価により神経活動の機能的回復を評価する革新的細胞治療アプローチです。

神経変性疾患の治療における再プログラム幹細胞由来前駆細胞における化学遺伝学的制御

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