神経変性疾患の治療における再プログラム幹細胞由来前駆細胞における化学遺伝学的制御

私たちの研究は、神経変性疾患の根底にある病原性メカニズムを説明すると同時に、高度な技術を統合して臨床応用のための効果的な細胞治療技術を開発することに焦点を当てています。私たちの最近の研究は、パーキンソン病マウスモデルに化学遺伝学的に改変された幹細胞を移植しました。1つの細胞のニューロン活動をデザイナードラッグで調節し、電気生理学的モニタリングと行動評価を行います。私たちは主に、遺伝子工学にCRISPR、神経活動を監視するための電気生理学、パーキンソン病モデルにおける機能回復を評価するための行動アッセイに利用しています。移植片細胞の効率は、神経変性疾患を治療する幹細胞ベースの治療における適切な適応症、生存率、宿主組織への機能的寄与によって高まります。腫瘍発生を含む悪影響に関連する制御されていない細胞活動。

ヒトの再プログラム幹細胞ニューロンとドライバーニューロンの技術を活用することで、設計薬CNOの投与によりニューロンの活動を正確に制御する手段が提供されます。

[講師]まず、50〜100ナノグラムの線形化ベクター、フラグメント1とフラグメント2を1〜3モル比で、2Xクローニングミックスとともに穏やかに混合します。混合物を摂氏55度で1時間インキュベートし、ギブソンアセンブリを使用して相同組換えを促進します。AAVS1部位を標的とするガイドRNAをPX458ベクターのBBS1部位に挿入します。再プログラムされた幹細胞を培地に維持し、細胞密度を1ミリリットルあたり2〜500万個の細胞を目指します。次に、2〜500万個の細胞、各ドナープラスミド2マイクログラム、および2マイクログラムのGRNAプラスミドを100マイクロリットルのエレクトロポレーションバッファーに混合します。細胞とプラスミドの混合物をキュベットに移してエレクトロポレーションを行います。次に、エレクトロポレーションされた細胞を、ポリ-D-リジンとラミニンでコーティングされた6ウェルプレートに移します。ウェルあたり約500,000個の細胞を2ミリリットルの培地に分配します。エレクトロポレーションを72時間行った後、フローサイトメーターを使用して蛍光陽性細胞を選別します。ZsGreen検出用のFITCチャネルを使用してソーターを設定します。ベースライン蛍光を定義するために、未処理の人工神経幹細胞をネガティブコントロールとして含めます。単一のZsGreen陽性細胞をポリ-D-リジンとラミニンで事前にコーティングされた96ウェルプレートにプレートし、ウェルあたり200マイクロリットルの培地を追加します。培養物を7〜14日間維持します。緑色の蛍光タンパク質フィルターセットを備えた倒立蛍光顕微鏡を使用して、蛍光を示す単一クローンを単離します。コーティングされた48ウェルプレート上の陽性細胞を増殖させた後、それらを2つの部分に分割し、1つは継続培養用、もう1つはジェノタイピング用に分割します。候補クローンからゲノムDNAを抽出します。目的の遺伝子の挿入を確認するための1つと、ホモ接合性クローンとヘテロ接合性クローンを区別するための2つのプライムリペアを使用してPCRミックスを調製します。細胞を消化し、PBSで洗浄し、250 Gで3分間遠心分離します。麻酔した動物に、マイクロリットルあたり5マイクログラムの濃度で3マイクロリットルの6-ヒドロキシドーパミンの片側定位注射を行います。正しい座標を使用して、右線条体をターゲットにします。病変を検証するために、手術の 4 週間後に生理食塩水に溶解した 0.5 ミリリグラム/ミリリットルの溶液を使用して、1 キログラムあたり 1 ミリグラムのアポモルヒネの腹腔内注射を投与します。調製した細胞懸濁液4マイクロリットルをパーキンソン病マウスモデルに定位注射します。細胞移植後の複数の時点でシリンダーテストを実行します。直径20センチメートル、高さ30センチメートルのガラスビーカーを平らで反射しない面に置きます。次に、トップビューカメラを円柱の上に配置して、全直径をキャプチャします。各マウスをシリンダーの中央に置き、セッションごとに 3 分間の同時ビデオ録画を開始します。セッションが終わったら、マウスをホームケージに戻します。3分間のセッション中にマウスの上肢の動きを評価します。両方の前肢による接触の合計に対する、障害のある前肢による壁の接触の数を計算します。生理食塩水またはクロザピンN-オキシドのいずれかを1キログラムあたり1.2ミリグラムの用量で腹腔内注射で投与します。クロザピンN-オキシド投与後のパーキンソン病マウスモデルにおける行動調節を評価するために、シリンダーテストを再度実施します。麻酔をかけた動物から脳を抽出した後、すぐに氷冷したスクロースベースの人工脳脊髄液に入れて細胞の完全性を維持しますビブラトームを使用して、脳を厚さ300〜400マイクロメートルのセクションにスライスします。ガス入力設定を調整して、摂氏 34 度で 95% の酸素と 5% の二酸化炭素と平衡化します。脳スライスを人工脳脊髄液で満たされたチャンバーに移します。 ガラスピペットに氷の細胞内溶液をロードし、電極抵抗が7〜10メガオームになるようにします。スライスを、摂氏34度で酸素化された人工脳脊髄液と毎分2ミリリットルで超融合した水中記録チャンバーにマウントします。赤外示差干渉造影顕微鏡下で電動マイクロマニピュレータを用いたピペットの位置決め穏やかな吸引を使用して全細胞構成を確立し、1ギガオームを超える抵抗を持つニューロンにパッチを当てます。パッチクランプアンプを使用して細胞をマイナス70ミリボルトでクランプし、10キロヘルツのサンプリングレートで8分間、ベースラインの自発的な興奮性シナプス後電流を取得します。ベースライン測定の直後に、50マイクロモルのクロザピンN-オキシドを記録チャンバーに追加します。データの記録を 16 分間継続し、自発的な興奮性シナプス後電流周波数または振幅の変化を監視します。最後に、クロザピン N-オキシド溶液を新鮮な人工脳脊髄液に置き換えてウォッシュアウト手順を実行し、記録を続けてシナプス活動の回復を評価します。クロザピンN-オキシドを用いた血液遺伝学的調節は、生理食塩水処理と比較して、hM4Di移植マウスでは対側前肢の動きを減少させ、hM3Dq移植マウスでは増加させ、双方向の行動制御を実証した。電気生理学的記録により、hM4Di移植細胞は自発的な興奮性シナプス後電流の間隔が長く、ピーク振幅が小さいのに対し、hM3Dq移植細胞は間隔が短く、振幅が大きく、シナプス活動の抑制と増強がそれぞれ示されていることが明らかになりました。免疫蛍光分析により、移植されたhM4DiおよびhM3Dq細胞におけるチロシンヒドロキシラーゼとZsGreenのin vivo発現が確認され、移植片の統合の成功がサポートされました。