複雑な糞便群集の連続培養のためのバイオリアクターアセンブリ
2025年4月25日
このプロトコルは、嫌気性条件下での複雑な糞便群集の連続フロー培養に利用されるミニバイオリアクターアレイの組み立てを詳述しています。また、さらなる分析のために、反応器の組み立て、接種、およびサンプリングの方法についても説明します。
私たちは、がんの発生、進行、治療反応に対する細菌の影響に焦点を当てて、宿主細菌の相互作用と、内因性および外因性要因が健康にどのように影響するかを研究します。細菌群集における抗 PD-1 免疫チェックポイント阻害剤を研究し、細菌代謝産物が抗 PD-1 療法の有効性を高めることを発見しました。
in vivo でマイクロバイオームに対する宿主因子の影響を分離することは、複数の影響があるため困難です。マイクロバイオリアクターアレイは、特定のプロセスの制御された検査を可能にし、微生物群集への直接的な影響を明らかにします。このプロトコルは、制御された条件下で糞便群集を培養する費用対効果の高い方法を提供し、研究者が比較的迅速に実験を並行して実行できるようにします。
[講師]まず、3Dプリントされた6ウェルリアクターアレイを入手します。1/8インチPTFEチューブから25mmのストリップを12枚切り取り、カミソリで端を削ります。各ストリップの一端を、25〜28スレッドフィッティングを備えたオスルアーのネジ穴に挿入します。フィッティングをアレイの指定された廃棄物とサンプルの開口部にしっかりとねじ込みます。次に、マイクロスターバーを各リアクターウェルに挿入します。各リアクターウェルのソース穴に1/4-28のオスネジをねじ込みます。各リアクターウェルの廃棄物とソース接続用のネジフィッティングにメスのルアーホースバーアダプターフィッティングをねじ込みます。次に、メス ルアー X を 3-32/2 インチ ホース バーブ アダプター フィッティングに、サンプル ポートの 1/4-28 ネジ フィッティングにねじ込みます。ホースバーブアダプターの上にゴム製セプタムを置き、上部を折ります。次に、廃棄物ラインとソースライン用のE-LFL 2.06ミリメートルチューブを2セット切断します。お湯を使用してチューブを柔らかくし、取り付けを容易にします。チューブをメスのルアーXから1/8インチのホースバーブアダプターフィッティングに取り付けて、ソースと廃棄物の接続を行います。次に、ロックリングXから1/8インチのホースバーブアダプターをチューブのもう一方の端に取り付けたオスルアーを固定します。メスのルアーXを1/16インチのホースバーブアダプターにねじ込みます。適切なサイズの2ストップチューブを、対応するソースと廃棄物の接続に接続します。次に、別のメス ルアー X から 1/16 インチ ホース バーブ アダプターをチューブのもう一方の端に固定します。すべてのソースおよび廃棄物フィッティングに対してこれを繰り返した後、ロックリングXから1/8インチのホースバーブアダプターフィッティングを備えたオスルアーをE-LFL2チューブに挿入します。すべてのピースの各 2 ストップ チューブ セクションの端にある、空いているメス ルアー X から 1/16 インチ ホース バーブ アダプターに一端を取り付けます。すべてのソースおよび廃棄物フィッティングに対してこれを繰り返した後、メスのルアーTの両端を使用して、反応器ウェル1と2のソースライン用のE-LFL 2.06ミリメートルチューブを接続します。次に、両端にロックリングXから1/8インチのアダプターフィッティングを備えたオスルアーで5センチメートルのチューブをTの中央出口に固定し、2番目のTジャンクションにつながります。次に、3番目のリアクター用のE-LFL 2.06ミリメートルソースチューブを2番目のTの反対側に接続します。一方の端にロックリングXから1/8インチへのアダプターが付いたオスのルアーと、もう一方の端にロックリングXから1/8インチのアダプターが付いたメスのルアーを持つ別の5センチメートルのチューブセグメントを取り付けます。次に、ロックリングX付きのオスルアーを1/8インチホースバーブアダプターフィッティングを25センチメートルのE-LFL 2.06ミリメートルチューブの一端に取り付けます。メスのルアーXから1/8インチのホースバーブアダプターフィッティングをもう一方の端に固定し、アルミホイルで覆います。廃棄物収集ボトルを組み立てるには、2 リットルのボトルに 2 穴のキャップをゆるく固定します。オス 1/4-28 ネジ継手をキャップの両方の穴に挿入します。次に、1/8インチのホースバーブアダプターを備えたメスルアーを、キャップにあらかじめ取り付けられたPTFEチューブに接続されていないおねじフィッティングに取り付けます。5センチメートルのE-LFL 2.06ミリメートルチューブをボトルのホースバーブアダプターに接続します。ホイルで覆う前に、ロックリングXから1/8インチホースバーブアダプターを備えたオスルアーをチューブのもう一方の端に取り付けます。最後に、ボトルキャップ全体をアルミホイルで覆い、摂氏121度、15psiで45分間オートクレーブ滅菌します。オートクレーブ滅菌が完了したら、フィッティングとホイルシールを締め、反応器を嫌気性チャンバーに48時間置いてから使用してください。嫌気性チャンバー内のリアクターアレイを、1,600 RPMに設定された磁気撹拌プレートの上に合わせます。次に、ソースラインと廃棄物ラインの両方の2ストップチューブを、対応する蠕動ポンプのクランプに取り付けます。クランプを所定の位置にロックする これが使用前25時間以内に行われた場合は。それ以外の場合は、チューブの摩耗を減らすために緩めたままにしてください。次に、ソースボトルからホイルキャップを取り外します。フィッティングをオスルアーから 1/4-28 ねじ継手にねじ込み、これらの開口部が内部 PTFE チューブに接続されていることを確認します。 ホイルキャップを取り外し、0.22マイクロメートルのシリンジフィルターをソースボトルと廃液ボトルの両方の5センチメートルのベントラインに取り付けます。適度な速度で流れを開始し、反応器への充填を開始します。各反応器ウェル内のウエストラインチューブがソースチューブよりも低い位置にあることを確認し、各ウェルの過充填や完全な空にならないようにしてください。反応器が充填され始めたら、すべての井戸が同じ量に達し、媒体がウエストラインに流れ込んでから、反応器を一晩脱気するまで確認してください。まず、実験材料を嫌気性チャンバーに24時間移します。必要な糞便接種量を計算した後、極低温バイアルに入った保存された糞便サンプルを嫌気性チャンバーに移し、15分間解凍します。広口径ピペットチップを使用して、極低温バイアルから糞便を50ミリリットルの円錐形チューブに移します。密閉チューブを200 gで5分間遠心分離して、微粒子を沈殿させます。チューブを嫌気性チャンバーに戻します。次に、上清を取り除きます。オートクレーブ実験用スパチュラを使用して、5.7グラムの糞便固形物を新しい50ミリリットルの円錐形チューブに移します。17.1ミリリットルの嫌気性滅菌生理食塩水をチューブに加え、しっかりと密封します。次に、前述のように遠心分離する前に、チューブを5分間渦巻きさせます。10%漂白剤の実験用ワイプを使用して、各反応器の上部にあるセプタムを少なくとも2分間滅菌します。サンプルを嫌気性チャンバーに戻した後、上清を新しい50ミリリットルの円錐形チューブにピペートします。次に、3.8ミリリットルの糞便スラリー上清を、16ゲージの1.5インチ針を取り付けた6つの別々の5ミリリットル注射器に移します。反応器セプタムから漂白剤ワイプを取り外します。次に、針を中隔に挿入し、3.8ミリリットルの糞便スラリーを各反応器にゆっくりと注入してから、反応器を一晩放置します。16〜18時間のインキュベーション後、反応器への流れを開始します。糞便スラリーを注入した直後に磁気撹拌プレートを最高速度に設定します。両方の反復反応器の微生物群集構成は時間の経過とともに変化し、異なる種は日々にわたって相対存在量が変化しました。クロストリジウム属などの気難しい嫌気性細菌は、すべての時点で各反応器で一貫して検出されました。
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概要
本プロトコルでは、嫌気条件下で複雑な糞便コミュニティの連続フロー培養を行うためのミニバイオリアクターアレイの構築について詳しく説明します。これにより、微生物コミュニティに影響を与える特定のプロセスの制御された検討が可能になります。
研究の主要構成要素
科学分野
- 微生物学
- バイオテクノロジー
- 免疫学
背景
- 宿主細菌間の相互作用は、健康を理解する上で極めて重要である。
- がんの発生および治療反応に対する細菌の影響は顕著である。
- マイクロバイオームに対する宿主因子の影響を単離して解析することは困難である。
- ミニバイオリアクターアレイは、糞便コミュニティの制御された研究を容易にする。
研究目的
- 制御された条件下で糞便微生物群集を培養する。
- 迅速に結果を得るため、並行して実験を行うことを可能にする。
- 特定のプロセスが微生物群集に及ぼす影響を明らかにする。
使用した手法
- ミニバイオリアクターアレイの組み立て。
- 複雑な糞便菌集団のリアクターへの接種。
- さらなる解析のためのサンプリング。
- 嫌気条件下での連続流培養。
主な結果
- 細菌の代謝産物はanti-PD-1療法の有効性を高める。
- マイクロバイオリアクターアレイにより、微生物プロセスの制御された検討が可能になる。
- 糞便コミュニティを培養するための費用対効果の高い手法である。
- 迅速な並行実験を促進する。
結論
- ミニバイオリアクターアレイは、マイクロバイオーム研究において貴重なツールとなります。
- 細菌間の相互作用を理解することは、がん治療戦略の策定に寄与します。
- 制御された条件下では、実験結果の信頼性が向上します。
よくある質問
産業上の重要性
ミニバイオリアクターアレイを用いた複雑な糞便微生物群集の制御培養により、疾患や治療反応に関連するマイクロバイオーム駆動のメカニズムを精密に検証することが可能になります。このシステムは、環境変数を分離し、ホスト因子を切り離すことで、仮説に基づいた研究をサポートし、マイクロバイオーム研究における予測の信頼性を向上させます。本アプローチは、ホストと微生物の相互作用に焦点を当てたバイオ医薬品パイプラインにおける、初期探索およびメカニズム的なリスク低減のために戦略的に配置されています。
バイオファーマR&Dにおける戦略的応用
初期発見およびターゲット検証
- 定義された環境曝露に対する微生物コミュニティの反応を直接的に検証できる。
- 宿主由来の共変量から細菌による影響を分離することで、メカニズム的なリスク低減をサポートする。
- 制御された条件下で、微生物コンソーシアまたは単一株の機能的検証を容易にする。
- マイクロバイオームを標的とした治療仮説に対する予測の信頼性を向上させる。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- ダウンストリームのスクリーニングワークフローに向けて、検証済みで再現性のある微生物系を調製します。
- コミュニティ組成および代謝産物の定量的測定のためのアッセイ条件を標準化します。
- 並行実験を可能にし、複数の変数や化合物の評価を加速させます。
- 多様なマイクロバイオーム研究におけるスケーラビリティとプラットフォームの再利用をサポートします。
翻訳・前臨床研究
- in vitroの微生物コミュニティモデルを、疾患に関連する曝露および介入条件に適合させます。
- 探索段階の知見から、マイクロバイオーム調節戦略の前臨床検証までの連続性を提供します。
- リスク調整に基づいた、マイクロバイオームベースの治療コンセプトの進展を可能にします。
- 微生物の代謝活性に関連するトランスレーショナルバイオマーカーの同定を支援します。
パイプラインおよびワークフローの統合
このミニバイオリアクターシステムは、マイクロバイオームの動態と機能に関する、制御された仮説駆動型の研究を可能にすることで、創薬から前臨床に至る一連の流れへと統合されます。
- 探索生物学：特定の環境的または薬理学的変数を分離することで、帰無仮説の検証およびパスウェイの解明を支援します。
- スクリーニング：微生物コミュニティの組成および代謝リードアウトについて、再現性のある定量的な出力を提供します。
- 分析：実験条件の統計的比較およびタイムコース解析を容易にします。
- トランスレーショナルリサーチ：制御された摂動研究を可能にすることで、in vitroでの知見をin vivoまたは前臨床モデルへと繋げます。
- エンタープライズ再利用：さまざまな治療領域にわたる継続的なマイクロバイオーム研究のために、モジュール式で適応可能なプラットフォームを提供します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：マイクロバイオームを標的とした研究において、予測の信頼性を高め、メカニズム的な曖昧さを低減します。
- 運用の価値：再現性と拡張性を確保するため、培養およびサンプリングのワークフローを標準化します。
- 戦略的価値：マイクロバイオームプログラムにおいて、根拠に基づいたゴー/ノーゴー判断および資本効率の高いポートフォリオの選別を可能にします。
- ポートフォリオへの影響：マイクロバイオームベースの治療薬候補の、リスク調整後の優先順位付けおよび開発推進を支援します。
実施上の検討事項
- 嫌気性微生物学およびバイオリアクターの組み立てに関する専門知識が必要です。
- 嫌気チャンバーやペリスタルティックポンプなどの専門的な機器へのアクセスが必須となります。
- 培地、接種、およびサンプリングプロトコルの厳格なチーム間標準化が必要です。
- プロトコルの変更により、さまざまなモデルシステムや実験設計に適応させることが可能です。
- ワークフロー全体を通じて厳格な嫌気条件および無菌状態を維持する必要があるため、制約があります。
バイオファーマ FAQ
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:03
Assembly and Sterilization of a 6-Well Reactor Array for Anaerobic Fecal Microbiota Culture
5:40
Setup and Initialization of the Reactor Array in an Anaerobic Chamber
7:03
Preparation and Inoculation of Fecal Microbiota in Anaerobic Reactors
9:10
Results
