Name: HepG2細胞における代謝制御Akt活性化ダイナミクスの生細胞フェルスター共鳴エネルギー移動イメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-23T13:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: 学ぼう、HepG2細胞におけるAkt活性化ダイナミクスの生細胞FRETイメージング手法を用いた代謝制御の可視化方法。この技術はインスリンシグナル伝達とがん代謝研究への貢献が期待されます。

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<table><tbody><tr><td>0.25%トリプシン-EDTA</td><td>ギブコ</td><td>カタログ#25200-056</td><td>細胞洗浄には氷冷PBSを使用する</td></tr><tr><td>15 mmガラス底細胞培養皿</td><td>巣</td><td>カタログ#801001</td><td></td></tr><tr><td>2&nbsp;mL Nalgene極低温バイアル</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>カタログ#5012-0020</td><td></td></tr><tr><td>5 mLストライペット血清ピペット</td><td>コーニング</td><td>カタログ#4487</td><td></td></tr><tr><td>95%エタノール</td><td>ケルメル</td><td>カタログ#C028005</td><td></td></tr><tr><td>A1 HD25/A1R HD25 共焦点顕微鏡</td><td>ニコン</td><td>https://www.nikon.com/</td><td>倍率:40倍、開口数(NA):1.30、ピクセル滞留時間:2.4ミリ秒、ピクセルサイズ:1024</td></tr><tr><td>アンピシリン</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>カタログ#A9393</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン(BSA)</td><td>VWRライフサイエンス</td><td>カタログ#N208-10g</td><td></td></tr><tr><td>コーニング 25&nbsp;cm2 長方形培養フラスコ</td><td>コーニング</td><td>カテゴリ#430639</td><td></td></tr><tr><td>Countess 3 自動セルカウンター</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>http://www.thermofisher.com/#AMQAX2000</td><td></td></tr><tr><td>Countess 細胞計数チャンバースライド</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>http://www.thermofisher.com/#C10228</td><td></td></tr><tr><td>デジタルボルテックスミキサー</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>https://www.thermofisher.com/</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>カタログ#D2650</td><td></td></tr><tr><td>エッペンドルフ セーフロックチューブ 1.5&nbsp;ミリリットル</td><td>エッペンドルフ</td><td>カタログ#022363204</td><td></td></tr><tr><td>EZ-PCRマイコプラズマ検出キット</td><td>生物産業</td><td>カタログ# 20-700-20</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清、認定済み、オーストラリア</td><td>ギブコ</td><td>カタログ#10099141</td><td></td></tr><tr><td>グルタMAXサプリメント</td><td>ギブコ</td><td>カタログ#35050061</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad プリズム 9</td><td>GraphPadソフトウェア</td><td>https://www.graphpad.com/</td><td></td></tr><tr><td>ヘップG2</td><td>認証細胞培養物の国立コレクション</td><td>#CSTR:19375.09.3101HUMSCSP510&nbsp;http://www.cellbank.org.cn/</td><td></td></tr><tr><td>浸漬油タイプ37</td><td>カーギル研究所</td><td>猫 #16237</td><td></td></tr><tr><td>インスリン</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>カタログ#I5500-50MG</td><td>37度まで暖かくします。使用前にC</td></tr><tr><td>LBブロス(1x)</td><td>インビトロゲン</td><td>カタログ#10855001</td><td></td></tr><tr><td>最小必須媒体(MEM)</td><td>ギブコ</td><td>カタログ#11095080</td><td>37度まで暖かくします。使用前にC</td></tr><tr><td>マイスピン 12&nbsp;ミニ遠心分離機</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>https://www.thermofisher.com/</td><td></td></tr><tr><td>ナノドロップワン</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>https://www.thermofisher.com</td><td></td></tr><tr><td>ニコンプランフルオア40&times;/1.30オイルレンズ</td><td>ニコン</td><td>https://www.nikon.com/</td><td></td></tr><tr><td>NIS-エレメント-AR</td><td>ニコン</td><td>https://www.nikon.com/</td><td></td></tr><tr><td>非必須アミノ酸(NEAA)(100倍)</td><td>ギブコ</td><td>カタログ#11140050</td><td></td></tr><tr><td>ワンショットLB寒天プレート&nbsp;</td><td>インビトロゲン</td><td>カタログ#A55802</td><td></td></tr><tr><td>ワンショット Stbl3 化学的に有能な E.&nbsp;大腸菌</td><td>インビトロゲン</td><td>カタログ#C737303</td><td></td></tr><tr><td>パラフィルム</td><td>パラフィルム</td><td>カタログ#B8R05606</td><td></td></tr><tr><td>PBS(リン酸緩衝生理食塩水)</td><td>ギブコ</td><td>カタログ#10010023</td><td></td></tr><tr><td>pEevee-iAkt-NES (7,033&nbsp;bp)</td><td>三浦 et&nbsp;al31</td><td>https://benchling.com/s/seq-q46zFYCfl0swLAun0t28/edit</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>ギブコ</td><td>カテゴリ#15070063</td><td></td></tr><tr><td>プラスモシン予防薬</td><td>インビボジェン</td><td>猫#ant-mpp</td><td></td></tr><tr><td>ポリ-L-リジン臭化水素酸塩&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>カタログ#P4832</td><td></td></tr><tr><td>精密汎用浴槽</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>https://www.thermofisher.com/</td><td></td></tr><tr><td>QIAprepスピンミニプレップキット</td><td>キアゲン</td><td>カタログ #27106</td><td></td></tr><tr><td>スナップジーン</td><td>DotmaticsのSnapGene</td><td>https://www.snapgene.com</td><td></td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム(100 mM)</td><td>ギブコ</td><td>カタログ#11360070</td><td></td></tr><tr><td>シリンジフィルターユニット、0.22&nbsp;&ミュー;m</td><td>ミリポール</td><td>カタログ#SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>東海ヒットステージトップインキュベーター</td><td>東海ヒット</td><td>https://www.tokaihit-livecell.com/stagetopincubator</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure DNase/RNase フリー蒸留水</td><td>インビトロゲン</td><td>カタログ#10977015</td><td></td></tr><tr><td>Xfectトランスフェクション試薬</td><td>タカラバイオ</td><td>カタログ#631317</td><td></td></tr></tbody></table>

hepg2細胞における代謝制御akt活性化ダイナミクスの生細胞フェルスター共鳴エネルギー移動イメージング

Live-Cell F&#246;rster Resonance Energy Transfer Imaging of Metabolically Regulated Akt Activation Dynamics in HepG2 Cells

HepG2細胞におけるAkt活性化を調べるために、細胞をプレコートイメージングディッシュに播種し、Aktリン酸化のリアルタイムモニタリングを可能にするように設計されたFRETベースのバイオセンサーpEevee-iAkt-NES(図2A)でトランスフェクションしました。トランスフェクション後、細胞は無血清培地で4時間血清飢餓状態を経験し、代謝状態を同期させ、基礎インスリンシグナル伝達を最小限に抑えました。
その後、細胞をさまざまなインスリン濃度(0 pM、300 pM、400 pM、500 pM、400 pM、100 pM、および0 pM)に曝露して、インスリンシグナル伝達経路を系統的に活性化しました。 図10Aに示すように、Aktリン酸化の用量依存的な増加が観察されました。特に、300 pMのインスリンでリン酸化の急激な増加が起こり、Aktの最大活性化の閾値を示しました。この濃度を超えると、リン酸化レベルは横ばいになり、500 pMまで徐々に増加しました。...

HepG2細胞における代謝制御Akt活性化ダイナミクスの生細胞フェルスター共鳴エネルギー移動イメージング

Metabolically regulated Akt activation is a critical node in the insulin signaling cascade and provides valuable insights into the relationship between ...

細胞の不均一性は、本質的に平均化された細胞動態の複雑さを正確に記述する障害です。だからこそ、私たちは単一細胞をイメージングするためにここにいます。遺伝的にコードされたFRETバイオセンサーの最近の開発により、特異性が向上し、細胞内のAktのリアルタイム追跡に革命が起こり、異種の理解と個別化された薬物療法の開発に役立ちます。がんと糖尿病は複雑な代謝経路を経由します。がんにおけるインスリンシグナル伝達経路の生体複雑性を解読するために、最先端の生細胞FRETイメージングを単一細胞分解能で使用します。FRET信号のノイズとスペクトルクロストークを最小限に抑えるには、共焦点顕微鏡、ハードウェア、ソフトウェア構成の最適化、レーザー出力の微調整、検出器ゲインの調整が重要であることがわかりました。ウェスタンブロッティングのような従来のバルク法では、空間的な時間的詳細が欠けており、細胞の不均一性が隠されています。私たちのプロトコルは、生細胞FRETイメージングを使用して細胞応答を高精度かつ正確にキャプチャすることで、このギャップを埋めます。まず、1ミリリットルあたり0.1ミリグラムのポリ-L-リジン溶液をイメージングディッシュに加え、ディッシュを揺らして表面全体を覆います。一晩インキュベートした後、皿から余分なポリ-L-リジン溶液を吸引します。PBSで表面を3回優しくすすぎ、それぞれ5分間休ませて、結合していないポリ-L-リジンを完全に除去します。PBSを吸引し、コーティングされたイメージングディッシュを摂氏37度で少なくとも3時間自然乾燥させます。次に、トランスフェクションの24〜48時間前に、プレコートされたイメージング皿にHepG2細胞を播種し、70〜90%のコンフルエンスに達することを確認します。トランスフェクション試薬を、Forster Resonance Energy Transferバイオセンサーをコードするプラスミドとともに解凍し、ボルテックスします。短時間回転して、チューブの底にあるすべての混合物を集めます。8マイクログラムのプラスミドを反応バッファーと混合し、ボルテックスを高速で5秒間使用して100マイクロリットルの最終容量にします。短く回転させて、チューブの底に混合物を集めます。希釈した血漿DNAを含むチューブに2.4マイクロリットルのトランスフェクションポリマーを加え、よく混合します。バイオセンサーとポリマー混合物を摂氏37度で15分間インキュベートし、ナノ粒子複合体を形成します。チューブを5, 000 Gで5秒間回転させて、底に内容物を集めます。100マイクロリットルのナノ粒子複合体溶液全体を細胞培養培地に滴下し、プレートを前後に軽く揺らして混合します。プレートを摂氏37度で4時間から一晩インキュベートします。細胞からナノ粒子複合体を除去した後、溶液を2ミリリットルの新鮮な完全増殖培地と交換します。分析時までプレートを摂氏37度のインキュベーターに戻します。蛍光顕微鏡下で細胞を分析します。イメージングディッシュから培地を取り出し、1X PBSでディッシュを2回すすぎ、各すすぎを5分間持続させます。皿の端の周りの各皿に2ミリリットルの飢餓培地を追加します。細胞を摂氏37度で4時間インキュベートします。次に、コンピューターの電源を入れ、共焦点顕微鏡本体とアクセサリの電源を順番にオンにします。その後、キーをオンの位置に回し、レーザー発射トグルスイッチを切り替えて、レーザーシステムをアクティブにします。次に、レーザーロックスイッチを時計回りに回転させて、両方のレーザーラインのオン位置にします。最後に、システムコントローラーの電源を入れます。デスクトップから NIS-Elements AR ソフトウェアを起動します。取得用のA1をクリックしてイメージングセットアップを開始し、実験要件に基づいて適切な光学構成を選択します。顕微鏡ステージ上部インキュベーターを取り付け、ネジで固定します。内部のウォーターバスに滅菌の二重蒸留水を入れます。次に、トップヒーターを取り付け、ステージヒーター、バスヒーター、レンズヒーターの電源を入れます。40X油浸レンズを95%エタノールで湿らせたレンズペーパーで拭き取り、対物レンズに少量の浸漬油を置きます。次に、HepG2細胞を含むイメージング皿を顕微鏡ステージに配置し、ホルダーで固定します。チャンバーを閉じ、細胞を1〜2時間インキュベートして平衡化します。NIS-Elements ARの[ファイル]メニューからND取得ウィンドウを起動します。[時間] タブを選択して、タイムラプス イメージングの間隔、期間、およびループを設定します。XYタブをクリックし、追加ボタンを押して、焦点を合わせたイメージング用のHepG2細胞を含めます。次に、ZボックスをオンにしてZ位置を設定します。[参照] をクリックして、保存先フォルダーを選択します。[ファイル名] ボックスに実験名を入力します。[今すぐ実行]をクリックして取得を開始し、タイムラプスイメージングプロセスを開始します。インスリンを補給した培地なしで最大30分間ベースライン測定値を記録します。定期的にイメージングを一時停止します。ガラス底皿から培地をそっと取り出し、適切なインスリン濃度を添加した培地1ミリリットルを加えます。画像取得を再開し、実験の最後に [完了] をクリックして閉じます。最後に、分析のために取得した画像をバックアップし、安全に保存します。インスリン刺激時にAktリン酸化の用量依存的な増加が観察され、300ピコモルのインスリンで急激な増加が見られました。この濃度を超えると、リン酸化レベルは頭打ちになり、インスリンが減少した後も下がりませんでした。正規化された FRET 比も同様の傾向を示し、インスリン刺激時にシグナルが増加し、インスリン離脱時にベースラインに戻れませんでした。連続したインスリン刺激により、正規化されたFRET比の漸進的な増加が観察され、用量依存的なAkt活性化応答が支持されました。

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がん研究

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リアルタイム細胞代謝フラックス分析装置を使用して骨芽細胞生体エネルギーをモニタリング

このプロトコルは、内因性代謝補酵素、還元型ニコチンアミドアデニン(リン酸)ジヌクレオチド(NAD(P)H)、および酸化フラビンアデニンジヌクレオチド(FAD)の蛍光イメージングおよび分析について記載しています。NAD(P)HおよびFADの自己蛍光イメージングは、細胞代謝を評価するための標識フリーの非破壊的方法を提供します。...

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過分極 13C NMRを用いた生細胞のリアルタイム代謝検出

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