脆弱Xメッセンジャーリボ核タンパク質を欠くヒト人工多能性幹細胞由来アストロサイトの作製とキャラクタリゼーション

この研究は、4つの脳特異的なヒト星状細胞と、脆弱X症候群などの神経発達障害によってそれらがどのように変化するかに焦点を当てています。以前の研究では、主にニューロンを研究するために動物モデルが使用されていたため、この研究はこの研究分野に新しい次元を追加します。

動物実験からのメカニズムの洞察は、臨床的成功は限られています。主な課題は、ヒト由来のニューロンとアストロサイトについて同様の洞察を得ることです。

私たちのプロトコルは、脆弱X症候群で調節不全、解糖、およびミトコンドリア代謝を示す風特異的アストロサイトの機能生成に成功し、疾患生物学におけるグリア細胞の役割の調査を可能にしました。健康と病気における神経機能におけるグリアの重要な役割に関する証拠が増えているにもかかわらず、脆弱X症候群などの神経発達障害においてヒト星状細胞がどのように影響を受けるかについてはほとんど知られていません。

今後、このフレームワークに基づいて、アストロサイトとそのニューロンとの相互作用が病気によってどのように変化するか、そしてこれらが治療的介入によってどのように修正されるかを研究します。

[講師]まず、高度なDMMF 12で1対60の比率で希釈したマトリゲルで6膨潤皿をコーティングします。コーティングされた皿は摂氏2〜8度の温度で保管してください。培養当日に、皿からコーティング材料を取り除き、1ミリリットルの完全な必須8培地を、最終濃度1Xの岩石阻害剤とともに加えます。皿をインキュベーターに入れます。ヒト人工多能性幹細胞(IPSC)を加える前に、5%の二酸化炭素で摂氏37度に設定します。コロニーの接着性を高めるために、最終濃度1 Xのロックインヒビターを含む完全な必須8培地にヒトIPSCを播種します。翌日、完全なエッセンシャルエイト培地を、ロックインヒビターを含まない新鮮な培地に交換します。細胞が80%のコンフルエンスに達するまで培地を毎日補充し続けますが、これには約4〜5日かかります。コロニーが80%の合流点に達したら、コラゲナーゼと分散の混合物を加えて酵素的に皿から分離します。コロニーが浮き上がり始めたら、インキュベーターから皿を取り出し、酵素活性を中和するために2ミリリットルのDPBSを加えます。DPBSを使用して、コロニーをこすり落とし、幅広のボード10ミリリットル血清学的ピペットを使用して、懸濁液を15ミリリットルの円錐形のチューブに収集します。次に、10ミリリットルの血清学的ピペットを使用して、懸濁液を2〜3回穏やかに粉砕してコロニーを分解します。コロニーが定住するのを許します。約2分後、チューブ内に約1ミリリットルの液体を残しながらDPBS酵素混合物を吸引します。次に、2ミリリットルのDPBSをチューブに加え、軽くたたいてコロニーを再懸濁させて混合します。それらを落ち着かせ、このプロセスを2回繰り返して残留酵素を除去します。上清を除去した後、コロニーを1ミリリットルの完全な必須8培地に再懸濁し、新しく準備したマトリゲルコーティング皿にプレートします。前述のように、ヒト人工多能性幹細胞を酵素的に持ち上げます。それらを、化学的に定義された培地を含む非接着性の100ミリメートル懸濁培養皿にプレートします。細胞懸濁液を毎分40回転でオービタルシェーカーに常酸素条件下で7日間置き、コルチコ球の発達を促進します。8日目に、コルチコ球を細胞増殖培地に移し、7日間維持します。グリアの仕様を誘導するには、コルチコ球をグリア濃縮培地で2週間インキュベートして、初期のグリア球を取得します。初期グリア球の成熟のために、塩基性線維芽細胞増殖因子Hを1ミリリットルあたり20ナノグラムの白血病抑制因子に置き換え、球体を4週間維持します。

成熟培地で4週間後、グリア濃縮培地で球体を長期間維持し続けます。凝集と生存率の喪失を防ぐために、滅菌された工業用ブレードを使用して、2週間ごとにグリア球を機械的に切り刻みます。培地全体をDNase1に置き換えて、チョッピングから生成されたDNAフラグメントを除去します。次に、パパイン解離キットを使用して、グリア球を星状細胞前駆細胞の単層に解離します。解離した細胞を、1〜80希釈でマトリゲルでプレコートした処理された接着皿にプレートします。アストロサイト前駆細胞をグリア濃縮培地で80%のコンフルエントに達するまで増殖させます。継代細胞は使用済み培地を取り出し、それを円錐形のチューブに集めます。酵素細胞剥離培地を細胞に加え、1〜2分間待ちます。細胞が剥離し始めたら、使用済み培地を加えて酵素活性を中和します。細胞懸濁液を回収し、800 Gで2分間遠心分離します。上清を廃棄した後、細胞をグリア濃縮培地に再懸濁します。ウェルあたり6細胞の約10乗を1〜80希釈でマトリゲルコーティング皿にプレートします。凍結保存のために、細胞ペレットを90%コルチコ球増殖培地と10%凍結保護剤の冷たい混合物に再懸濁します。再懸濁した細胞をクライオバイアルに移します。すぐにクライオバイアルをクライオボックスに移動し、摂氏マイナス80度の冷凍庫で一晩保管します。翌日、すべてのクライオバイアルを液体窒素タンクに移し、長期保管します。ビメントンおよび核因子IAMマーカーによる免疫染色により解離した星状細胞前駆細胞を特徴付けるヒトIPSC由来APCの4つの脳領域特異性を確認するために、ヒトフォークヘッドボックスG1とヒトホメオボックスB4のリアルタイムQPCR解析を行います。APCを星状細胞と星状細胞分化培地に14日間分化させます。アストロサイトを35ミリメートルのガラス底皿に、1皿あたり3細胞の5乗の密度でプレートし、アデノシン5リン酸三乗に対する応答を測定します。細胞をガラス底に24時間付着させます。付着した細胞をカルシウムを含まないハンクのバランス塩溶液で3回洗浄します。次に、5マイクロモル比のメトリックジウレイドと0.02%プルロニックF127を含む培地で細胞を2:00 AMに室温で1時間インキュベートします。細胞を培地で2回洗浄した後、培地をハンクバランスソルト溶液を含む2ミリモルのカルシウムと交換します。集束ドリフト補正倒立顕微鏡で60倍油浸対物レンズを使用して、毎秒2フレームで細胞を画像化します。最後に、25秒のマークで最終濃度5ミリモルのATPを添加した後、ATP誘発カルシウム応答を記録します。ヒトIPSCコロニーは、免疫染色によって確認されたように、多能性マーカーを発現しました。脆弱X症候群に由来するAPCと対照株は、ビメンチンとNFIA陽性細胞の割合が同等であった。対照および脆弱X症候群の両方のヒト誘発多能性幹細胞からのアストロサイト前駆細胞は、HOXB4と比較してFox G1のアップレギュレーションを示し、前脳の同一性を示しています。ヒトIPSC脆弱X症候群系統に由来するアストロサイトは、GFAP発現数の減少を示しました。対照および脆弱 X 症候群の星状細胞は ATP 誘発性カルシウム過渡現象を示しましたが、応答者の数は脆弱 X 症候群の星状細胞では有意に少なかった。最初のATP誘発カルシウム過渡現象のピーク振幅は、対照細胞と比較して脆弱X症候群の星状細胞で有意に低かった。ヒトIPSC由来の脆弱X症候群星状細胞は、解糖、解糖能力、および解糖予備能の増加を示しましたが、対照星状細胞と比較して最大呼吸の有意な減少を示しました。