Name: プラスミドDNAトランスフェクションとmRNAヌクレオフェクションデリバリーを用いたヒト細胞におけるCRISPRエピゲノム編集 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-30T13:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: 学ぶCRISPRエピゲノム編集の方法。プラスミドDNAトランスフェクションとmRNAヌクレオフェクションを用いて、ヒト細胞にエピゲノムエディターを導入し、DNA切断を伴わない標的遺伝子制御を実現する技術です。

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私たちの体内のすべての細胞のゲノム含有量はほぼ同じですが、各細胞タイプの転写プロファイルは大きく異なります。DNAおよびヒストンタンパク質のエピジェネティックな修飾は、転写発現の重要な調節因子です。転写活性ユークロマチンは、コンパクトで転写活性のないヘテロクロマチンと比較して、明確なエピジェネティックマークによって特徴付けられます。例えば、ヘテロクロマティック領域は、ヒストン3のリジン9(H3K9me3)上のトリメチル化、ヒストンH3のリジン27(H3K27me3)上のトリメチル化、および遺伝子プロモーター1のグアニンの隣のシトシン(CpG)上のDNAメチル化を含む、抑制的なヒストン修飾によって定義されます。活性遺伝子発現のゲノム領域は、典型的には、ヒストン3(H3K4me3)1のリジン4上のヒストンアセチル化およびトリメチル化によって定義されます。
CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)革命は、ゲノム配列のプログラムによる改変を可能にする豊富なツールを生み出しました。CRISPR技術は、プログラム可能な標的配列で核酸を切断できる原核生物の防御メカニズムに基づいています。CRISPRヌクレアーゼ2,3,4、塩基エディター5,6、およびプライムエディター7,8は、DNA切断およびこれらの切断の修復を通じて、哺乳類ゲノムのDNA配列を変化させることができる。これらの戦略は効果的ではあるが、オフターゲット部位9,10および大規模なゲノム構造変異11,12,13,14,15を引き起こす可能性がある。CRISPRベースの代替ツールにより、基礎となるDNA配列を変更することなく、遺伝子の活性化と抑制の扱いやすい調節が可能になります。これらのツールは、ヌクレアーゼ欠損Cas9(dCas9)を利用し、sgRNA配列によって決定される標的部位でのDNA結合を可能にし、クロマチンランドスケープ16,17,18を変化させるエフェクタータンパク質との組み合わせを可能にします。エフェクタータンパク質、例えば、エピジェネティックなライター、リーダー、およびイレイサーは、直接dCas9に融合させるか、またはdCas9に融合したペプチドスカフォールド(SunTagなど)、またはMS2−MCPシステム16,17,18などのsgRNA上のRNAスカフォールドによってリクルートすることができる。プログラム可能な転写制御ツールの例としては、CRISPR活性化(CRISPRa)19,20,21およびCRISPR干渉(CRISPRi)22,23が含まれる。CRISPRaは、転写機構を直接動員することで機能し、標的の転写遺伝子発現を増加させます19。対照的に、CRISPRiは、抑制的なエピジェネティックなマークであるH3K9me3を確立することにより転写を抑制します22。
エピゲノム編集の進歩により、これらのツールを科学分野を超えて広く利用できるようになりました。異なるエフェクタードメインおよびタンパク質の融合により、利用可能なエピゲノムエディター18,24,25,26,27,28,29,30のツールキットが拡大した。さらに、エピゲノムエディタは、エピジェネティックな修飾31,32,33,34,35,36、エフェクター37,38,39、およびエフェクター突然変異28,40,41の役割を解読するために使用されます遺伝子調節において。具体的には、CRISPRiおよびCRISPRaは、細胞生存42および細胞運命43,44,45,46,47を含むさまざまな生物学的プロセスの機能ゲノミクススクリーニングに使用されている。さらに、エピゲノム編集は、ex vivo細胞工学およびin vivo治療の治療可能性を秘めています18。
ここでは、ヒト細胞株におけるプログラム可能な転写抑制のための2つのdCas9ベースのエピゲノムエディター、CRISPRi 22およびCRISPRoff 48を適用する方法について説明します。CRISPRiは、ZNF10(KOX1)やZIM3などのジンクフィンガータンパク質からdCas9を抑制的KRABドメインに融合させたものです22,23。CRISPRiが特定の遺伝子プロモーターを標的とすると、KRABドメインはH3K9me3ライターであるSETDB1をリクルートして標的遺伝子を抑制します(図1A)。CRISPRiが一過性に発現すると、標的遺伝子座で確立されたH3K9me3は維持されず、遺伝子発現は時間とともに回復する32,48。機能ゲノミクスへの応用など、CRISPRiを用いた安定的なノックダウンを行うためには、sgRNAとともに細胞内でCRISPRiが構成的に発現することが不可欠です。最近、CRISPRoffは遺伝性エピゲノム編集をプログラムするように操作された48。CRISPRoffは、dCas9のKRABドメインおよびde novo DNAメチルトランスフェラーゼ複合体であるDNMT3AおよびDNMT3Lへの単一タンパク質融合体です。ヒト細胞におけるCRISPRoffの一過性パルスは、標的遺伝子におけるH3K9me3の沈着とDNAメチル化をプログラムし、DNAメチル化とH3K9me3の維持による標的遺伝子の長期抑制をもたらす(図1B)48。さらに、エピゲノムの編集を元に戻すことができます。例えば、CRISPRoffによって安定にサイレンシングされた遺伝子は、TET1-dCas9によって再活性化することができ、これにより、標的遺伝子座49のDNAメチル化マークを酵素的に除去することができる。
このプロトコールでは、エピゲノムエディターの一過性発現のための2つの導入方法、プラスミドDNAトランスフェクションとmRNAヌクレオフェクションについて詳しく説明します。さらに、フローサイトメトリーを使用して、 CLTA と CD55の2つの内在性遺伝子におけるエピゲノム編集の有効性を評価する方法について概説します。これらの方法は、追加のエディターを使用して他のエピゲノム編集実験に適合させて適用することも、異なる遺伝子を標的とするために使用することもできます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68089/68089fig01.jpg"> 
図1:CRISPRiおよびCRISPRoffエピゲノム編集メカニズムとワークフローの概略図。(A)sgRNA導入遺伝子およびCRISPRiエピゲノムエディターの線形概略図。CRISPRiとsgRNAの添加により、抑制的なH3K9me3ヒストンマークの付加が可能になり、標的遺伝子座を沈黙させることができます。最高レベルのサイレンシングは、CRISPRi添加後早期に達成され、遺伝子ターゲットは通常、数回の継代後に再活性化されます。(B)sgRNA導入遺伝子およびCRISPRoffエピゲノムエディターの線形概略図。目的の遺伝子を標的とする細胞にCRISPRoffを追加すると、CpG部位でのDNAメチル化とともに抑制的なH3K9me3が追加され、標的遺伝子がサイレンシングされます。CRISPRoffによるサイレンシングは遺伝性であり、トランスフェクションの早い段階で高レベルのサイレンシングが達成され、複数の細胞分裂にわたって持続します。(C)トランスフェクション法によるエピゲノム編集のタイムラインの概要。0日目に、細胞をトランスフェクション用にプレーティングします。1日目に、エディタープラスミドとガイドプラスミドをトランスフェクションにより細胞に導入できます。3日目に、細胞はフローサイトメトリーを介してBFP発現について評価されます。BFPの割合は、各条件に対する実験の最終的なサイレンシング効果を決定するための正規化因子として使用されます。6日目以降は、この日に最高レベルのサイレンシングが達成されるため、細胞は対象のレポーターをサイレンシングするために分析されます。(D)エピゲノムエディターとsgRNAプラスミドを細胞に滴下するトランスフェクション法の概要。(E)ヌクレオフェクション法によるエピゲノム編集のタイムラインの概要。このプロトコルでは、mRNAは0日目に細胞にヌクレオフェクションされます。細胞は、フローサイトメトリー分析を使用して、ヌクレオフェクション後3日目にサイレンシングについて評価されます。(F)ヌクレオフェクションプロトコールの概要。適量の細胞とmRNAを混合し、ヌクレオフェクターキュベットに添加します。sgRNAがヌクレオフェクションによって導入される場合、この混合物にsgRNAを添加することもできます。キュベットをヌクレオフェクターに入れ、適切なパルスコードを使用してmRNAを細胞に導入します。ヌクレオフェクション後、細胞はプレーティングされ、後日分析のために継代されます。(G)エピゲノム編集のためのプラスミドトランスフェクションとmRNAヌクレオフェクション戦略の比較。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68089/68089fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

<table><tbody><tr><td>4D-Nucleofector</td><td>Lonza</td><td>AAF-1003</td><td></td></tr><tr><td>96-well tissue culture plates</td><td>Corning</td><td>3596</td><td></td></tr><tr><td>96-well U-bottom Plate</td><td>Corning</td><td>351177</td><td></td></tr><tr><td>APC anti-human CD55 Antibody</td><td>BioLegend</td><td>311312</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSymphony A1 Flow Cytometer</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bleach</td><td>Waxie</td><td></td><td></td>11003428432</tr><tr><td>遠心分離機</td><td>Eppendorf</td><td>5425</td><td></td></tr><tr><td>Countess Automated Cell Counter</td><td>Thermo Scientific</td><td>Countess 3</td><td></td></tr><tr><td>CRISPRoff transfection plasmid</td><td>Addgene&nbsp;</td><td></td><td></td>167981</tr>希釈<tr><td>剤 2 フローサイトメトリー用血液学試薬(シース液)</td><td>Thermo Scientific</td><td>23-029-361</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, High Glucose</td><td>Thermo Scientific</td><td></td> 11965118 <td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14-190-250</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf tubes</td><td>Thomas scientific</td><td>1159M35</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Avantor Seradigm</td><td>89510-186</td><td></td></tr><tr><td>ロンザ・ウォーカーズビル&nbsp;SF細胞株 4D-Nucleofector X Kit L</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0281111</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE&trade;T7 ULTRA 転写キット</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM1345</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>PCR strip tubes</td><td>USA Scientific&nbsp;</td><td>1402-4700</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン-グルタミン</td><td>Gibco</td><td>10378016</td><td></td></tr><tr><td>pLG1 sgRNA発現プラスミド</td><td>Addgene&nbsp;</td><td></td><td></td>217306</tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>22-400-105</td><td></td></tr><tr><td>SF Cell Line 96-well Nucleofector&reg;&nbsp;キット</td><td>ロンザ</td><td>V4SC-2096</td><td></td></tr><tr><td>組織培養インキュベーター</td><td>PHCbi</td><td>MCO-170AICUVDL-PA</td><td></td></tr><tr><td>TransIT-LTI トランスフェクション試薬</td><td>Mirus</td><td>MIR 2306</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA (0.25%)</td><td>Gibco</td><td>25200114</td><td></td></tr></tbody></table>

プラスミドdnaトランスフェクションとmrnaヌクレオフェクションデリバリーを用いたヒト細胞におけるcrisprエピゲノム編集

CRISPR Epigenome Editing in Human Cells using Plasmid DNA Transfection and mRNA Nucleofection Delivery

すべてのエピゲノム編集実験において、エピゲノム編集の効率を評価するためには、適切な制御が重要です。ヒトゲノムのどの配列も標的としないコントロールsgRNAの使用をお勧めします。ノンターゲティングガイドコントロールを使用すると、標的遺伝子座の変化が、エピゲノムエディターの過剰発現や非特異的結合だけでなく、その部位に誘導されるエピゲノムエディターによってもたらされることを確信できます。さらに、レポーター遺伝子ベースの実験では、レポーター発現の変化が、dCas9が標的遺伝子座に結合して一時的に転写を妨げる立体障害ではなく、エピゲノムエディターの融合によるものであることを確認するために、dCas9のみのコントロールを使用することをお勧めします(図2F)。
トランスフェクション実験では、エピゲノムエディターとBFPなどの蛍光タンパク質融合遺伝子を追加で使用することをお勧めします。この融合により、エピゲノムエディターでうまくトランスフェクションされた細胞を顕微鏡法とフローサイトメトリーで可視化することができます。トランスフェクションに...

プラスミドDNAトランスフェクションとmRNAヌクレオフェクションデリバリーを用いたヒト細胞におけるCRISPRエピゲノム編集

Epigenetics refers to chemical modifications of histone proteins and DNA that can regulate the expression of genes. The human epigenome is altered ...

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