Name: プラズモニックナノピンセットを用いた単一非修飾タンパク質のコンフォメーションダイナミクスのモニタリング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: 学ぶプラズモニックナノピンセットを用いた単一非修飾タンパク質のコンフォメーションダイナミクスモニタリング手法。リアルタイムでタンパク質の構造変化と結合動態を観察し、アルツハイマーやパーキンソン病関連タンパク質の挙動解明に貢献します。

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<ol><li>Peter Lu, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sizing+up+single-molecule+enzymatic+conformational+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Soc+Rev%22%5BJournal%5D)">Sizing up single-molecule enzymatic conformational dynamics.</a> Chem Soc Rev. 43 (4), 1118-1143 (2014).</li>
<li>Mazal, H., Haran, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+FRET+methods+to+study+the+dynamics+of+proteins+at+work%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Single-molecule FRET methods to study the dynamics of proteins at work.</a> Curr Opin Biomed Eng. 12, 8-17 (2019).</li>
<li>Ritchie, D. B., Woodside, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+structural+dynamics+of+proteins+and+nucleic+acids+with+optical+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Str+Biol%22%5BJournal%5D)">Probing the structural dynamics of proteins and nucleic acids with optical tweezers.</a> Curr Opin Str Biol. 34, 43-51 (2015).</li>
<li>Neupane, K., Solanki, A., Sosova, I., Belov, M., Woodside, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+metastable+structures+formed+by+small+oligomers+of+%CE%B1-Synuclein+probed+by+force+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Diverse metastable structures formed by small oligomers of α-Synuclein probed by force spectroscopy.</a> PLoS One. 9 (1), e86495(2014).</li>
<li>Hughes, M. L., Dougan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+physics+of+pulling+polyproteins%3A+a+review+of+single+molecule+force+spectroscopy+using+the+AFM+to+study+protein+unfolding%5BTitle%5D)+AND+%22Rep+Prog+Phys%22%5BJournal%5D)">The physics of pulling polyproteins: a review of single molecule force spectroscopy using the AFM to study protein unfolding.</a> Rep Prog Phys. 79 (7), 076601-076601 (2016).</li>
<li>Young, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+mass+imaging+of+single+biological+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Quantitative mass imaging of single biological macromolecules.</a> Science. 360 (6387), 423-427 (2018).</li>
<li>Schmid, S., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanopores%3A+a+versatile+tool+to+study+protein+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Essays+Biochem%22%5BJournal%5D)">Nanopores: a versatile tool to study protein dynamics.</a> Essays Biochem. 65 (1), 93-107 (2021).</li>
<li>Van Meervelt, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+conformational+changes+and+controlled+orientation+of+native+proteins+inside+a+protein+nanoreactor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Real-time conformational changes and controlled orientation of native proteins inside a protein nanoreactor.</a> J Am Chem Soc. 139 (51), 18640-18646 (2017).</li>
<li>Awasthi, S., Ying, C., Li, J., Mayer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+determination+of+the+size+and+shape+of+single+%CE%B1-Synuclein+oligomers+in+solution%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Simultaneous determination of the size and shape of single α-Synuclein oligomers in solution.</a> ACS Nano. 17 (13), 12325-12335 (2023).</li>
<li>Sµnchez-Rico, C., Von Vithenberg, L., Warner, L., Lamb, D. C., Sattler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+fluorophore+attachment+on+protein+conformation+and+dynamics+studied+by+spFRET+and+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry%22%5BJournal%5D)">Effects of fluorophore attachment on protein conformation and dynamics studied by spFRET and NMR spectroscopy.</a> Chemistry. 23 (57), 14267-14277 (2017).</li>
<li>Yin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+does+fluorescent+labeling+affect+the+binding+kinetics+of+proteins+with+intact+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectr%22%5BJournal%5D)">How does fluorescent labeling affect the binding kinetics of proteins with intact cells.</a> Biosens Bioelectr. 66, 412-416 (2015).</li>
<li>Berkovich, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rate+limit+of+protein+elastic+response+is+tether+dependent%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Rate limit of protein elastic response is tether dependent.</a> Proc Natl Acad Sci. 109 (36), 14416-14421 (2012).</li>
<li>Dahmardeh, M., Mirzaalian Dastjerdi, H., Mazal, H., Köstler, H., Sandoghdar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-supervised+machine+learning+pushes+the+sensitivity+limit+in+label-free+detection+of+single+proteins+below+10+kDa%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Self-supervised machine learning pushes the sensitivity limit in label-free detection of single proteins below 10 kDa.</a> Nat Meth. 20 (3), 442-447 (2023).</li>
<li>Becker, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+description+for+optical+mass+measurement+of+single+biomolecules%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Photon%22%5BJournal%5D)">A quantitative description for optical mass measurement of single biomolecules.</a> ACS Photon. 10 (8), 2699-2710 (2023).</li>
<li>Houghtaling, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+shape%2C+volume%2C+and+dipole+moment+of+individual+proteins+freely+transiting+a+synthetic+nanopore%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Estimation of shape, volume, and dipole moment of individual proteins freely transiting a synthetic nanopore.</a> ACS Nano. 13 (5), 5231-5242 (2019).</li>
<li>Plesa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+translocation+of+proteins+through+solid+state+nanopores%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Fast translocation of proteins through solid state nanopores.</a> Nano Lett. 13 (2), 658-663 (2013).</li>
<li>Schmid, S., Stömmer, P., Dietz, H., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanopore+electro-osmotic+trap+for+the+label-free+study+of+single+proteins+and+their+conformations%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Nanopore electro-osmotic trap for the label-free study of single proteins and their conformations.</a> Nat Nanotechnol. 16 (11), 1244-1250 (2021).</li>
<li>Shi, X., Verschueren, D. V., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+delivery+of+single+DNA+molecules+into+a+plasmonic+nanopore+for+label-free+optical+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Active delivery of single DNA molecules into a plasmonic nanopore for label-free optical sensing.</a> Nano Lett. 18 (12), 8003-8010 (2018).</li>
<li>Verschueren, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+optical+detection+of+DNA+translocations+through+plasmonic+nanopores%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Label-free optical detection of DNA translocations through plasmonic nanopores.</a> ACS Nano. 13 (1), 61-70 (2019).</li>
<li>Verschueren, D., Shi, X., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nano-optical+tweezing+of+single+proteins+in+plasmonic+nanopores%5BTitle%5D)+AND+%22Small+Meth%22%5BJournal%5D)">Nano-optical tweezing of single proteins in plasmonic nanopores.</a> Small Meth. 3 (5), 1800465(2019).</li>
<li>Peri, S. S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+low+affinity+binding+interactions+between+natural+killer+cell+inhibitory+receptors+and+targeting+ligands+with+a+self-induced+back-action+actuated+nanopore+electrophoresis+%28SANE%29+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Quantification of low affinity binding interactions between natural killer cell inhibitory receptors and targeting ligands with a self-induced back-action actuated nanopore electrophoresis (SANE) sensor.</a> Nanotechnology. 32 (4), 045501(2020).</li>
<li>Leong, I. W., Tsutsui, M., Yokota, K., Taniguchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salt+gradient+control+of+translocation+dynamics+in+a+solid-state+nanopore%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Salt gradient control of translocation dynamics in a solid-state nanopore.</a> Anal Chem. 93 (49), 16700-16708 (2021).</li>
<li>Juan, M. L., Righini, M., Quidant, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmon+nano-optical+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Photon%22%5BJournal%5D)">Plasmon nano-optical tweezers.</a> Nat Photon. 5 (6), 349-356 (2011).</li>
<li>Juan, M. L., Gordon, R., Pang, Y., Eftekhari, F., Quidant, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-induced+back-action+optical+trapping+of+dielectric+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Phys%22%5BJournal%5D)">Self-induced back-action optical trapping of dielectric nanoparticles.</a> Nat Phys. 5 (12), 915-919 (2009).</li>
<li>Pang, Y., Gordon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+trapping+of+12+nm+dielectric+spheres+using+double-nanoholes+in+a+gold+film%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Optical trapping of 12 nm dielectric spheres using double-nanoholes in a gold film.</a> Nano Lett. 11 (9), 3763-3767 (2011).</li>
<li>Pang, Y., Gordon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+trapping+of+a+single+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Optical trapping of a single protein.</a> Nano Lett. 12 (1), 402-406 (2012).</li>
<li>Kotnala, A., Gordon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+high-efficiency+trapping+of+nanoparticles+in+a+double+nanohole+optical+tweezer%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Quantification of high-efficiency trapping of nanoparticles in a double nanohole optical tweezer.</a> Nano Lett. 14 (2), 853-856 (2014).</li>
<li>Booth, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+of+the+dynamic+polarizability+of+macromolecules+for+single-molecule+optical+biosensing%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Modelling of the dynamic polarizability of macromolecules for single-molecule optical biosensing.</a> Sci Rep. 12 (1), 1995(2022).</li>
<li>Yousefi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+monitoring+of+in+situ+Iron+loading+into+single%2C+native+ferritin+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Optical monitoring of in situ Iron loading into single, native ferritin proteins.</a> Nano Lett. 23 (8), 3251-3258 (2023).</li>
<li>Yousefi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Flexibility+and+Disassembly+Kinetics+of+Single+Ferritin+Molecules+Using+Optical+Nanotweezers%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Structural Flexibility and Disassembly Kinetics of Single Ferritin Molecules Using Optical Nanotweezers.</a> ACS Nano. 18 (24), 15617-15626 (2024).</li>
<li>Peters, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+landscape+of+conformational+changes+for+a+single+unmodified+protein%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Biosens%22%5BJournal%5D)">Energy landscape of conformational changes for a single unmodified protein.</a> NPJ Biosens. 1 (1), 14-14 (2024).</li>
<li>Peters, M., McIntosh, D., Branzan Albu, A., Ying, C., Gordon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+tracking+of+proteins+through+plasmon-enhanced+interference%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nanosci+Au%22%5BJournal%5D)">Label-free tracking of proteins through plasmon-enhanced interference.</a> ACS Nanosci Au. 4 (1), 69-75 (2024).</li>
<li>Ying, C., et al. Watching single unmodified enzymes at work. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aYing%2C+C+%22arXiv%22">arXiv</a>. , (2021).</li>
<li>Yang-Schulz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+small+molecule+activator+binding+to+single+PR65+protein%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Biosensing%22%5BJournal%5D)">Direct observation of small molecule activator binding to single PR65 protein.</a> NPJ Biosensing. 2 (1), 1-10 (2025).</li>
<li>Yang, W., van Dijk, M., Primavera, C., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FIB-milled+plasmonic+nanoapertures+allow+for+long+trapping+times+of+individual+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">FIB-milled plasmonic nanoapertures allow for long trapping times of individual proteins.</a> iScience. 24 (11), 103237(2021).</li>
<li>Koya, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+plasmonic+nanocavities+for+optical+trapping-assisted+biosensing+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Optical+Mater%22%5BJournal%5D)">Novel plasmonic nanocavities for optical trapping-assisted biosensing applications.</a> Adv Optical Mater. 8 (7), 1901481(2020).</li>
<li>Goswami, A., Umashankar, R., Gupta, A. K., Aravindan, S., Rao, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+microstructured+surface+using+the+FIB%5BTitle%5D)+AND+%22J+Micromanufact%22%5BJournal%5D)">Development of a microstructured surface using the FIB.</a> J Micromanufact. 1 (1), 53-61 (2018).</li>
<li>Onuta, T. D., Waegele, M., DuFort, C. C., Schaich, W. L., Dragnea, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+field+enhancement+at+cusps+between+adjacent+nanoapertures%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Optical field enhancement at cusps between adjacent nanoapertures.</a> Nano Lett. 7 (3), 557-564 (2007).</li>
<li>Al-Ani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+PEG-thiol+derivatives+on+controlling+cellular+and+bacterial+interactions+with+gold+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Surf+Sci%22%5BJournal%5D)">The influence of PEG-thiol derivatives on controlling cellular and bacterial interactions with gold surfaces.</a> Appl Surf Sci. 462, 980-990 (2018).</li>
<li>Schuler, B., Hofmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+spectroscopy+of+protein+folding+dynamics-expanding+scope+and+timescales%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Str+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-molecule spectroscopy of protein folding dynamics-expanding scope and timescales.</a> Curr Opin Str Biol. 23 (1), 36-47 (2013).</li>
<li>Kopac, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+corona%2C+understanding+the+nanoparticle-protein+interactions+and+future+perspectives%3A+A+critical+review%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biol+Macromol%22%5BJournal%5D)">Protein corona, understanding the nanoparticle-protein interactions and future perspectives: A critical review.</a> Int J Biol Macromol. 169, 290-301 (2021).</li>
<li>Li, X., Guo, W., Xu, R., Song, Z., Ni, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interaction+mechanism+between+gold+nanoparticles+and+proteins%3A+Lysozyme%2C+trypsin%2C+pepsin%2C+%CE%B3-globulin%2C+and+hemoglobin%5BTitle%5D)+AND+%22Spectrochim+Acta+A+Mol+Biomol+Spectrosc%22%5BJournal%5D)">The interaction mechanism between gold nanoparticles and proteins: Lysozyme, trypsin, pepsin, γ-globulin, and hemoglobin.</a> Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc. 272, 120983(2022).</li>
<li>Emilsson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strongly+stretched+protein+resistant+poly%28ethylene+glycol%29+brushes+prepared+by+grafting-To%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl+Mater+Inter%22%5BJournal%5D)">Strongly stretched protein resistant poly(ethylene glycol) brushes prepared by grafting-To.</a> ACS Appl Mater Inter. 7 (14), 7505-7515 (2015).</li>
<li>Theil, E. C., Liu, X. S., Tosha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gated+pores+in+the+ferritin+protein+nanocage%5BTitle%5D)+AND+%22Inorg+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">Gated pores in the ferritin protein nanocage.</a> Inorg Chim Acta. 361 (4), 868-874 (2008).</li>
<li>Theil, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ferritin+iron+entry+and+exit+problem%5BTitle%5D)+AND+%22Inorg+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">The ferritin iron entry and exit problem.</a> Inorg Chim Acta. 297 (1), 242-251 (2000).</li>
<li>Takahashi, T., Kuyucak, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+properties+of+threefold+and+fourfold+channels+in+Ferritin+D%3Ddeduced+from+electrostatic+calculations%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Functional properties of threefold and fourfold channels in Ferritin D=deduced from electrostatic calculations.</a> Biophys J. 84 (4), 2256-2263 (2003).</li>
<li>Gemeinhardt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+imaging+of+single+proteins+secreted+from+living+cells+via+iSCAT+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Label-free imaging of single proteins secreted from living cells via iSCAT microscopy.</a> J Vis Exp. (141), e58486(2018).</li>
<li>Piliarik, M., Sandoghdar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+optical+sensing+of+single+unlabelled+proteins+and+super-resolution+imaging+of+their+binding+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Comm%22%5BJournal%5D)">Direct optical sensing of single unlabelled proteins and super-resolution imaging of their binding sites.</a> Nat Comm. 5 (1), 4495(2014).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>100x対物レンズ(NA = 1.25)</td><td>オリンパス</td><td>PLN100XO</td><td>1つの動きでレンズクリーニングティッシュのみのオイルを洗浄します</td></tr><tr><td>12-1ロータリー双方向マイクロ流体バルブ</td><td>Elveflow</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3/2ウェイソレノイドバルブ</td><td>Elveflow</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4x対物レンズ(NA = 0.1)</td><td>オリンパス</td><td>PLN4XP</td><td></td></tr><tr><td>エアガン</td><td>RSコンポーネント</td><td>666-6772</td><td></td></tr><tr><td>アバランチフォトダイオード(APD)</td><td>Thorlabs</td><td>APD120A / M</td><td>過飽和にならず、50 MHzの帯域幅、静電気に敏感な</td></tr><tr><td>バタフライレーザーダイオード</td><td>Thorlabs</td><td>FPL852S</td><td></td></tr><tr><td>電荷結合デバイス(カメラ)</td><td>Hikrobot</td><td>MV-CE200-10UC</td><td></td></tr><tr><td>結晶化皿</td><td>VWR</td><td>216-0065</td><td></td></tr><tr><td>データ収集カード&nbsp;</td><td>National Instruments</td><td>USB-6361</td><td>2 MHz サンプリングレート</td></tr><tr><td>両面テープ</td><td>Adhesive Research Inc</td><td>ARcare92712</td><td>レーザーカッターでフローセルの適切な形状をカット</td></tr><tr><td>エタノール</td><td></td><td></td><td>ヒュームフードのみ、手袋を使用</td></tr><tr><td>ファイバーポートコリメータ</td><td>Thorlabs</td><td>PAF2-A7B</td><td></td></tr><tr><td>ガラス顕微鏡カバースリップ(厚さ0.17mm)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>半波長板</td><td>Thorlabs</td><td>AHWP10M-980</td><td></td></tr><tr><td>Ideal-tek 120 mm、ステンレス製、ストレートピンセット</td><td>RS Components</td><td>282-7472</td><td>サンプル保持および剥離用 両面テープ</td></tr><tr><td>イソプロパノール(IPA)</td><td></td><td></td><td>ヒュームフードのみ、手袋使用</td></tr><tr><td>レンズクリーニングティッシュ</td><td>Thorlabs</td><td>MC-5</td><td></td></tr><tr><td>Metrosil 急速複製シリコーン部品 AおよびB</td><td>メトロデント</td><td>MSILR/1&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡スライド(75 mm x 26 mm)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>モジュラー光ピンセットシステム</td><td>Thorlabs</td><td>OTKB/M-CUSTOM</td><td></td></tr><tr><td>対物油</td><td>オリンパス</td><td></td><td>手袋を使用して、2oC-8oC</td></tr>フォト<tr><td>ダイオードレーザーマウント</td><td>Thorlabs</td><td>CLD1015</td><td></td></tr><tr><td>圧電</td><td>コントローラーThorlabs</td><td></td><td></td>MDT693B</tr><tr><td>圧電ステージ</td><td>Thorlabs</td><td>Nanomax 300</td><td></td></tr><tr><td>平面凹レンズ (f = -50 mm)</td><td>Thorlabs</td><td>LC1715-B</td><td></td></tr><tr><td>平面凸レンズ (f = 150 mm)</td><td>Thorlabs</td><td>LA1433-B</td><td></td></tr><tr><td>平面凸レンズ (f = 60 mm)</td><td>Thorlabs</td><td>LA1134-B</td><td></td></tr><tr><td>ポリ(エチレングリコール)メチルエーテルチオール(PEG-チオール)800 MW</td><td>Sigma Aldrich</td><td>729108</td><td>2oC-8oC</td></tr><tr><td>PTFEチューブ(ID:0.18 mm)</td><td>Vici Jour</td><td>JR-T-6805-M25</td><td></td></tr><tr><td>PTFEチューブ(ID:0.8 mm)</td><td>Cole-Parmer</td><td>WZ-21942-72</td><td></td></tr><tr><td>SEM-FIB</td><td>Zeiss</td><td>Crossbeam 550</td><td>ガリウムイオン源ショート</td></tr><tr><td>パスダイクロイックミラー 805 nm</td><td>Thorlabs</td><td>DMSP805</td><td></td></tr><tr><td>シルバーミラー</td><td>Thorlabs</td><td>PF-10-03-P01</td><td></td></tr><tr><td>シリンジポンプ</td><td>ハーバード装置</td><td>70-4511</td><td></td></tr><tr><td>ウェラーエレム 120 mm ステンレス鋼、フラット、丸みを帯びたピンセット</td><td>RS コンポーネント</td><td>176-1150</td><td>ガラスカバースリップを保持し、フローセルから接着剤を剥がすため</td></tr></tbody></table>

プラズモニックナノピンセットを用いた単一非修飾タンパク質のコンフォメーションダイナミクスのモニタリング

Monitoring Conformational Dynamics of Single Unmodified Proteins using Plasmonic Nanotweezers

データ取得後、MATLABコードを使用して生データに対してデータ解析を実行し、APDによって収集された生データからトレースを生成できます。 図3 は、トラップ前のベースライン、レーザーが再びオンになる前に約5秒間オフになる前に透過率(ΔT/T0)と標準偏差の大きな変化が観察されるトラッピングイベントを含む、例示的なトラッピングトレースを示しています。標準偏差の大幅な減少とベースラインと同様のレベルへの感染の回復は、タンパク質の放出を示しています。線形ドリフトは、MATLAB 関数 detrend.m を使用してトレースから削除され、データの平均値がトレンド除去されたトレースに再度追加されます。場合によっては、セットアップが時間の経過とともにドリフトするため、トレースのトレンドを下げる必要があり、伝送が直線的に減少します( 図3の灰色のトレースを参照)。トラップ前後のベースライントレースの小さな変化は、 図4Aに示すように、最小の標準偏差でベースラインを最適化するためのステージ調整によるものです。時々、タンパク質分子はトラップされずにトレースに見える、パスバイタンパク質と呼ばれます。通過するタンパク質は、典型的なトラップ(図4B)と同様に、伝達の急激な変化として現れますが、 図4Aに示すように、持続時間が大幅に短くなります。パワースペクトル密度(PSD)は、さまざまな周波数で信号強度を提供することにより、タンパク質の捕捉を確認する別の分析を提供します。タンパク質の立体配座運動は、典型的には、単一分子分光学法40によって&gt;1μsの範囲で見られる。 図4C は、ベースラインと比較して、タンパク質をトラップすると、少なくとも10kHzの範囲(&gt;100μs)内でシグナル強度が高くなることを示しています。また、ベースラインが悪いと、タンパク質のコンフォメーション運動が重なる周波数範囲である50〜500Hzの周波数でノイズが増加する可能性があるため、ステージを最適化されたベースラインに合わせることの重要性も強調しています。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68093/68093fig03.jpg"> 
図3:単一タンパク質の完全なトラッピングトレース。 ベースライン、タンパク質のトラップ、タンパク質の放出など、完全なトラップの代表的なトレース。トラッピングの前後のトレースのジャンプは、アライメントによるものです。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68093/68093fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68093/68093fig04.jpg"> 
図 4: 一般的なトレース イベント。(A)ベースラインが悪いものから良いものへのアラインメントと、ホットスポットの近くを通過するタンパク質の例。(B)DNHホットスポットが空のベースラインからタンパク質がトラップされるまでのプロセスを示すトラッピングトレース。(C)(A)に示されている良好なベースラインと悪いベースラインと(B)にトラップされたタンパク質との間のパワースペクトル密度(PSD)プロット。PSD値が高いほど、特定の周波数でのノイズが大きいことを示します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68093/68093fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
ほとんどのトラッピングイベントは、図3のトレースと同じ一般的なパターンに従いますが、実験中に問題が発生することがあります。ほとんどの実験では、目的の実験が完了したら、レーザーをオフにしてタンパク質を手動で放出する必要があります。ただし、場合によっては、図5Aに示すように、タンパク質が介入せずにトラップを離れることがあります。逆に、レーザーをオフにした後でもタンパク質がトラップ部位に残ることがありますが、これはタンパク質がサンプルに付着している可能性があります。この固着により、レーザーをオフにしてからオンにした後、ノイズの多いトレースが発生します (図 5B を参照)。これが起こる可能性はタンパク質に依存し、一部のタンパク質は表面吸着を受けやすい41,42。PEG-チオールなどのコーティングを使用すると、タンパク質が付着する可能性を減らすことができます39,43。タンパク質間相互作用の研究など、望ましくない場合を除き、別の問題は、最初のトラップの後に2番目のタンパク質がトラップされるダブルトラップです。これは、最初のトラップと同様に、透過率がさらに急激に増加し、標準偏差が変化することを特徴としています (図 5C を参照)。 
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68093/68093fig05.jpg"> 
図5:望ましくないトラップイベントの例。(A) DNHホットスポットからのタンパク質の意図しない放出。 (B) DNHホットスポットのサンプル表面にタンパク質が付着した例。 (C) トレースジャンプは、2番目のタンパク質がトラップされ、最初のタンパク質がまだDNHホットスポットに残っている場合に発生します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68093/68093fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
アポフェリチン分子へのin situ鉄負荷で行われた代表的な実験は、タンパク質の立体配座ダイナミクスを調査するためのツールとしてのプラズモニックナノピンセットの使用を実証している29。フェリチンは、鉄を含まないアポフェリチンと鉄を充填したホロフェリチンの2つの状態に存在する鉄キャリアタンパク質です44,45。第一鉄は、3倍チャネルを通じてタンパク質に入り込み、そこで第二鉄に酸化され、タンパク質コア46に貯蔵される。図6Aは、タンパク質がトラップされている間に20分以上注入された鉄溶液によるアポフェリチンの典型的なトラップトレースを示しています。ポイントb-eで全体のトレースに沿って取得された20秒のトレースは、時間の経過とともにタンパク質に発生する変化についての洞察を提供します。図6Bでは、アポフェリチンは標準的なPBSバッファーにトラップされており、トレースに大きな変化は観察されません。図6C、Dは、トレースのS.Dの変動を示しており、これは、その3フォールドチャネルを介してタンパク質に鉄がロードされることによって引き起こされ、チャネルが開いているより動的な状態(apo-)と、チャネルが閉じている状態のよりコンパクトな状態(holo-)をもたらします。フェリチン分子が鉄で満たされると、フェリチン分子はホロフォームに移行し、図6Eに示すように安定したトラップトレースが得られます。図6B-Eの確率密度関数(PDF)は、タンパク質がさまざまな溶液条件に経時的にさらされたときに受ける変化をさらに示しています。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68093/68093fig06.jpg"> 
図6:トラップされたアポフェリチンへのin situ鉄のローディング。 (A)アポフェリチン分子をトラップしたDNHの全透過トレースに続いて、そのトラップ部位に鉄溶液を注入して、鉄の負荷に伴うフェリチンのコンフォメーション変化を観察します。(B)鉄溶液がホットスポットに到達する前にトラップされたアポフェリチンの20秒トラップトレース。(C、D)アポフェリチン分子が鉄溶液に曝露された後の20秒のトレースを捕捉します。青と紫のセグメントは、トレースのS.Dの高低を示し、それぞれフェリチンの柔軟なコンフォメーションとリジッドなコンフォメーションを示しています。(E)アポフェリチンを鉄溶液に&gt;20分間曝露した後の20秒間の捕捉痕跡。右側の確率密度関数(PDF)プロットは、透過の分布を示しており、青と紫のセグメントに色分けされています。この数値は平成29年から修正されています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68093/68093fig06large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
補足図1:3Dプリントされたフローセルに取り付けられた金DNHサンプル。 サンプルを専用のスロットに入れ、両面PET粘着テープを使用してフローセルに接着します。当社のフローセル設計の主要なパラメータと関連する測定値にはラベルが付けられています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68093/SI-1%20Sample%20mounted%20in%20flow%20cell_amended.tif" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足図2:金のDNHサンプルが取り付けられ、内壁にラベルが貼られたフローセルの背面。 サンプルは、複写シリコーンを使用してフローセルに密封されます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68093/SI-2%20Inner%20wall%20of%20hole%20in%20flow%20cell.tif" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足図3:金のDNHが取り付けられ、吸気孔と排気孔がラベル付けされたフローセルの図。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68093/SI-3%20Intake%20and%20outtake%20holes.tif" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

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