Sprague-Dawley(SD)ラットからの初代Retinal Müller細胞の単離と培養

このプロトコルは、Sprague-Dawley SDラットからの初代網膜ミュラー細胞の単離と培養について説明しており、科学界における網膜研究を支援できます。このプロトコルは、網膜郭清、CI の抽出と同定、および主要な制御に関する考慮事項をカバーしています。このプロトコルは、合法的なSDラックからRMCを抽出および回収するための効率的で標準化されたコスト効率の高い方法を確立します。RMCモデルは、糖尿病、正常などの病理学的状態をシミュレートし、薬物効果を支援するために使用できます。

[ナレーター]まず、D-Hankの溶液を2つの10センチメートルのガラス培養皿に注ぎます。新生SDラットを安楽死させ、消毒した後、滅菌湾曲した皿の上に置きます。歯のピンセットを使用して、眼瞼裂に沿ってまぶたの皮膚を引き裂き、ラットの眼球を露出させます。歯のないピンセットを開いて眼瞼裂と平行に保持して、眼窩を押し下げます。視神経に到達し、眼球が露出したら、ピンセットを閉じて眼球を持ち上げて抽出します。次に、D-Hankの溶液を入れたガラス培養皿に眼球を置きます。眼球をすすぎ、新鮮なD-Hankの溶液を入れた別の皿に移します。次に、湾曲した眼科用マイクロ鉗子を使用して、角膜と視神経の間の領域をそっと固定して角膜を露出させます。マイクロ角膜ハサミを使用して角膜強膜接合部に穴を開け、輪部に沿って円形に切ります。鉗子を解放し、視神経と強膜の接合部でリクランプする前に、長さ約2ミリメートルの対称的な強膜切開を2つ行います。次に、2番目の鉗子を使用して視神経根の近くをそっと押し、角膜視神経界面に圧力を向けます。水晶体組織が現れたら、慎重に取り除き、網膜組織が現れるまで押さえ続けます。鉗子を使用して、分離された網膜組織を別の滅菌培養皿に移します。培養皿の蓋を開け、先端が1ミリリットルのピペットを使用して、網膜組織を上下に約15回ピペットで移動させ、細かく砕きます。次に、組織を1ミリリットルの0.25%トリプシンとともに摂氏37度で5分間インキュベートします。培養皿をインキュベーターから取り出し、クリーンベンチに置きます。2ミリリットルの完全培地を加え、そっとピペットで消化を止めます。次に、細胞懸濁液を300メッシュのナイロンスクリーンを通して15ミリリットルの遠心分離機2にろ過します。培養皿を準備したPBSで洗浄し、残りの懸濁液を収集します。次に、チューブを室温で878Gで5分間回転させます。遠心分離後、上清を吸引して廃棄します。ペレットを2ミリリットルの完全培地に再浮遊し、再び878 Gで5分間遠心分離して細胞を精製します。上清を廃棄した後、細胞を2ミリリットルの完全培地に再懸濁します。3ミリリットルの完全培地を入れたT25フラスコを取り、1ミリリットルの細胞懸濁液を加えます。フラスコをインキュベーターに入れる前に、フラスコを十字パターンで振ってください。48時間のインキュベーション後、フラスコをインキュベーターから取り出し、クリーンベンチに置きます。使用済み培地を廃棄し、1%ペニシリンとストレプトマイシンを含む1ミリリットルのPBSで細胞付着面を3回洗浄します。次に、5ミリリットルの新鮮な完全培地を加え、細胞コンフルエントが90%を超えるまでインキュベーションを続けます。1%ペニシリンストレプトマイシンを含む1ミリリットルのPBSで細胞を3回洗浄します。次に、細胞を1ミリリットルの0.25%トリプシンEDTA溶液で1分30秒間インキュベートします。次に、倒立顕微鏡でフラスコを観察します。細胞が丸く見え、剥離し、浮き始めたら、2ミリリットルの完全培地をフラスコに加えて消化を終了します。次に、ピペットを使用して細胞懸濁液を吸引し、細胞懸濁液全体を 15 ミリリットルの遠心分離管に移します。フラスコの壁を1%ペニシリンストレプトマイシンを含む2ミリリットルのPBSですすぎ、同じチューブに加えます。チューブを室温で878 Gで5分間遠心分離します。上清を廃棄し、細胞ペレットを適切な量の完全培地に再懸濁します。最後に、必要に応じて、1対2または1対3の比率で細胞を継代します。2番目の継代網膜ミュラー細胞またはRMCは、円形または楕円形の核と豊富な細胞質を備えた星形または紡錘形の形態を示しました。 ヘマトキシリンとエオシンの染色により、豊富なピンク色の細胞質と、細い糸状構造によって相互接続された中央に位置する楕円形の核を持つ紡錘形および星形の細胞が明らかになりました。RMCの免疫蛍光染色により、グルタミンシンテターゼおよびアクアポリン-4に標識された細胞では強い赤色蛍光が見られ、CRALBP、Kir4.1およびビメンチンでは明るい緑色の蛍光が明らかになりました。NeuN、陰性対照は免疫蛍光分析で検出されず、RMC単離の特異性が確認されました。フローサイトメトリー分析では、細胞の98.7%がグルタミンシンテターゼ陽性、97%がCRALBP陽性であることが示され、RMCの純度が高いことが示されました。