Name: 除染された喀痰サンプルの標的次世代シーケンシングのためのマトリックスベースのDNA抽出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-06T15:05:00.000+00:00
Duration: 6 min 7 s
Description: 学ぶマトリックスベースDNA抽出法で除染喀痰からMycobacterium tuberculosisの標的次世代シーケンシングを実施する方法。磁気ビーズ精製によりDNA収量と純度を向上させ、臨床診断と研究応用に有用な再現性の高いプロトコルを提供します。

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この研究は、ステレンボッシュ大学の研究倫理委員会:生物学的および環境安全(REC:BES)によって承認されています:BES-2024-25384および人間研究倫理委員会:N21/09/093およびN09/11/296。
1. 喀痰沈殿物サンプル調製
注:次の手順は、DNA抽出の前にバイオセーフティレベル3(BSL3)ラボで実行する必要があります。
<ol>
	<li>N-アセチル-L-システイン(NALC)および水酸化ナトリウム(NaOH)(NALC/NaOH)を使用して以前に除染した喀痰沈殿物サンプルのアリコートを、500 μL-2 mLを1.5 mLまたは2 mLの低結合チューブに移して調製します。</li>
	<li>喀痰沈殿物サンプルの入ったチューブをチューブラックに直立させ、サンプルを80°Cのオーブンに入れ、1時間インキュベートして熱処理によりマイコバクテリアを不活化します。</li>
	<li>1時間後、サンプルが入ったチューブラックを取り外し、チューブの表面を拭き、バイオセーフティレベル2(BSL2)の実験室に輸送するために適切な容器に入れます。 注:サンプルを室温まで冷ましてから、さらに取り扱いまたは保管してください。</li>
</ol>
2. マトリックス懸濁液と高速ホモジナイザーによるDNA抽出(図2)
<ol>
	<li>開始する前に、直径2 mmのガラスビーズ3個を1.5 mLまたは2 mLのスクリューキャップチューブに加え、緩くキャップし、オートクレーブします(理想的にはDNA抽出の少なくとも1日前)。</li>
	<li>マトリックス懸濁液を冷蔵庫から取り出し、マグネチックスターラー(試薬ボトルに磁石が含まれています)に置き、試薬を室温に戻して試薬の混合を開始します。</li>
	<li>加熱ブロックのスイッチを入れ、56°Cに予熱します(2つの加熱ブロックが利用可能な場合は、2番目の加熱ブロックを100°Cに予熱します。 注:次の手順は、BSL2施設の実験台で実行できます。</li>
	<li>熱不活化した喀痰沈殿物サンプルを16,800 × g (またはフルスピード)で15分間遠心分離します。20-200 μLのピペットで上清を穏やかに吸引して捨て、ペレットが邪魔されないようにします。</li>
	<li>マトリックス懸濁液を穏やかに振盪して混合し(ボルテックスしないでください)、よく混合したマトリックス200μLを加えてペレットを再懸濁します。</li>
	<li>全容量を、直径2mmの滅菌済みガラスビーズ3個が入った1.5mLのスクリューキャップチューブにピペットで移します。</li>
	<li>サンプルを加熱ブロックに入れ、56°Cで15分間インキュベートします。 注:加熱ブロックからサンプルを取り出した直後に、ステップ2.7の後に加熱ブロックを100°Cに設定します(使用可能な加熱ブロックが1つしかない場合)。</li>
	<li>ボルテックスを10秒間使用してサンプルを均質化し、細胞を分散させます。</li>
	<li>サンプルを加熱ブロックに入れ、100°Cで10分間インキュベートします。</li>
	<li>高速ホモジナイザーを使用してサンプルを均質化し、次のパラメータを設定します:4.0 m/sで60秒の1サイクル。</li>
	<li>12,000 × g で5分間遠心分離します。130 μL の DNA 含有上清を、ペレット (細胞破片を含むマトリックス) を乱さずに、新しい 1.5 mL の低結合チューブに移します。マトリックスと細胞破片を含む最初のチューブを廃棄します。 注:安全な停止ポイント。停止する場合は、DNA精製を続行する準備ができるまで、サンプルを-20°Cで凍結します。</li>
	<li>磁気ビーズを用いたDNA精製を進めます。</li>
</ol>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68147/68147fig02v2.jpg"> 
図2:高速ホモジナイザーと組み合わせたマトリックスベースのDNA抽出法。 略語:HSH =高速ホモジナイザー。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68147/68147fig02v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
3. 磁気ビーズによるDNA精製(図3)
注:DNA精製を進める前に、手順3.1および3.2を実行してください。
<ol>
	<li>磁気ビーズを冷蔵庫から取り出し、容器を室温で30分間置いて平衡化します。あるいは、磁気ビーズストックボトルをボルテックスしてすべてのビーズを再懸濁し、1,280 μLのアリコートを新しいチューブに吸引し(21サンプルの精製用)、室温で平衡化します。</li>
	<li>1.8 mLのろ過滅菌水に7.2 mLの純粋なエチルアルコールを加えて、80%エタノールの9 mLバッチを準備します。 注:次の手順は、BSL2施設の実験台で実行できます。</li>
	<li>磁気ビーズストックボトルまたは準備されたアリコートを完全にボルテックスして、使用前にビーズが再懸濁されていることを確認します。10サンプルごとにボルテックスを繰り返して、均一な懸濁液を確保します。</li>
	<li>抽出したDNA(130 μL)に1.2倍容量(156 μL)の磁気ビーズを加えます。 注:大量のDNA(培養)を含むサンプルの場合、サンプルの小さなアリコート(例:50μL)を処理し、1.2倍容量の磁気ビーズで精製できます。</li>
	<li>10回ピペッティングしてサンプルを混合します。サンプルを室温で5分間インキュベートします。</li>
	<li>サンプルを1.5 mLチューブマグネティックラックに3分間、または液体が透明になるまで置きます。上清はビーズを乱さずに慎重に吸引して捨てます。</li>
	<li>チューブを磁石に取り付けた状態で、200 μLの80%エタノールを加え、ビーズが乱されず、30秒間インキュベートできるようにします。</li>
	<li>エタノールを慎重に吸引し、ビーズを乱さずに廃棄します。</li>
	<li>手順3.7を繰り返して、合計2回の洗浄を行います。</li>
	<li>2回目の洗浄後、エタノールを取り出して廃棄します。1〜10μLのピペットで残留エタノールを取り除きます。</li>
	<li>チューブを開いたままにして、ビーズを10分間、またはビーズがつや消しになるまで風乾させます。 注意: ビーズが過度に乾燥してひび割れないようにしてください。</li>
	<li>ビーズがつや消しになったら、すぐにチューブを磁石から取り外し、50 μLのヌクレアーゼフリー水(NFW)を各サンプルのビーズに直接加えます。すべてのチューブにNFWを加えた後、10回ピペッティングして個々のサンプルを混合します。チューブの内側にビーズが付着していないかチューブを検査し、必要に応じて混合手順を繰り返します。サンプルを室温で5分間インキュベートします。 注:インキュベーションは5分から10分に増やすことができますが、インキュベーション時間を5分未満に減らさないでください。</li>
	<li>チューブを磁気ラックに3分間、または液体が透明になるまで戻します。チューブを磁気ラックに載せた状態で、DNA含有上清を、明確にマークされた無菌の低結合チューブに移します。ビーズが上清に移らないようにしてください。 注:移し替え中にピペットチップにビーズが見える場合は、上清をマグネティックラックのチューブにピペットで戻し、さらに3分間分離します。ビーズを新しいチューブに移さないでください。 安全な停止ポイント。停止する場合は、NGSに適した方法を使用して定量を続行し、その後MTB tNGSアッセイを使用してPCR増幅を行う準備ができるまで、サンプルを-20°Cで凍結します。</li>
</ol>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68147/68147fig03.jpg"> 
図3:磁気ビーズを使用したDNAの精製と濃縮。 略語:NFW =ヌクレアーゼフリー水;tNGS = ターゲット次世代シーケンシング。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68147/68147fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

<ol><li>Global Tuberculosis Report 2024. Geneva: WHO. , World Health Organization. 
 <a target="_blank" href="https://www.who.int/teams/global-tuberculosis-programme/tb-reports/global-tuberculosis-report-2024">https://www.who.int/teams/global-tuberculosis-programme/tb-reports/global-tuberculosis-report-2024</a> (2024).</li>
<li>De Araujo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implementation+of+targeted+next-generation+sequencing+for+the+diagnosis+of+drug-resistant+tuberculosis+in+low-resource+settings%3A+a+programmatic+model%2C+challenges%2C+and+initial+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Public+Health%22%5BJournal%5D)">Implementation of targeted next-generation sequencing for the diagnosis of drug-resistant tuberculosis in low-resource settings: a programmatic model, challenges, and initial outcomes.</a> Front Public Health. 11, 1204064(2023).</li>
<li>Murphy, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+detection+of+drug-resistant+Mycobacterium+tuberculosis+using+targeted+next+generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Public+Health%22%5BJournal%5D)">Direct detection of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis using targeted next generation sequencing.</a> Front Public Health. 11, 1206056(2023).</li>
<li>Kambli, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+next+generation+sequencing+directly+from+sputum+for+comprehensive+genetic+information+on+drug+resistant+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Tuberculosis%22%5BJournal%5D)">Targeted next generation sequencing directly from sputum for comprehensive genetic information on drug resistant Mycobacterium tuberculosis.</a> Tuberculosis. 127, 102051(2021).</li>
<li>WHO Consolidated Guidelines on Tuberculosis.Module 3: Diagnosis. Rapid diagnostics for tuberculosis detection. Third edition. , World Health Organization. 
 <a target="_blank" href="https://iris.who.int/bitstream/handle/10665/376221/9789240089488-eng.pdf?sequence=1">https://iris.who.int/bitstream/handle/10665/376221/9789240089488-eng.pdf?sequence=1</a> (2024).</li>
<li>Catalogue of mutations in Mycobacterium tuberculosis. complex and their association with drug resistance. Second edition. , World Health Organization. 
 <a target="_blank" href="https://iris.who.int/bitstream/handle/10665/374061/9789240082410-eng.pdf?sequence=1">https://iris.who.int/bitstream/handle/10665/374061/9789240082410-eng.pdf?sequence=1</a> (2023).</li>
<li>Schwab, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+next-generation+sequencing+to+diagnose+drug-resistant+tuberculosis%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Targeted next-generation sequencing to diagnose drug-resistant tuberculosis: a systematic review and meta-analysis.</a> Lancet Infect Dis. 24 (10), 1162-1176 (2024).</li>
<li>Deeplex Myc-TB manual version 5. , GenoScreen. 
 <a target="_blank" href="https://acrobat.adobe.com/link/track?uri=urn%3Aaaid%3Ascds%3AUS%3A67c2b53f-c91d-3a73-a6ea-4769e7c8fe57">https://acrobat.adobe.com/link/track?uri=urn%3Aaaid%3Ascds%3AUS%3A67c2b53f-c91d-3a73-a6ea-4769e7c8fe57</a> (2023).</li>
<li>Shea, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+whole-genome+sequencing+and+reporting+of+drug+resistance+profiles+on+clinical+cases+of+Mycobacterium+tuberculosis+in+New+York+State%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Comprehensive whole-genome sequencing and reporting of drug resistance profiles on clinical cases of Mycobacterium tuberculosis in New York State.</a> J Clin Microbiol. 55 (6), 1871-1882 (2017).</li>
<li>Conceição, E. C., et al. Mycobacterium tuberculosis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aConcei%C3%A7%C3%A3o%2C+EC+%22DNA+extraction+using+InstaGene+Matrix+and+high-speed+homogenizer+from+clinical+primary+culture%22">DNA extraction using InstaGene Matrix and high-speed homogenizer from clinical primary culture</a>. , https://www.protocols.io/view/mycobacterium-tuberculosis-dna-extraction-using-in-dhvs366e (2024).</li>
<li>Nilgiriwala, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+sequencing+from+sputum+for+tuberculosis+disease+diagnosis%2C+lineage+determination%2C+and+drug+susceptibility+prediction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genomic sequencing from sputum for tuberculosis disease diagnosis, lineage determination, and drug susceptibility prediction.</a> J Clin Microbiol. 61 (3), e0157822(2023).</li>
<li>Laboratory Services in Tuberculosis Control Part II: Microscopy. Geneva: WHO. , World Health Organization. 
 <a target="_blank" href="https://iris.who.int/bitstream/handle/10665/65942/WHO_TB_98.258_(part2).pdf?sequence=2">https://iris.who.int/bitstream/handle/10665/65942/WHO_TB_98.258_(part2).pdf?sequence=2</a> (1998).</li>
</ol>

2023年には、世界で推定370万人の結核患者が診断も治療も受けられず、結核が世界の健康にもたらす大きな脅威が浮き彫りになりました1。WHOは、2023年に約40万人がリファンピシン耐性結核(RR-TB)または多剤耐性結核(MDR-TB)を発症したと推定しています1。結核とDR-TBの迅速な診断と治療は、結核の発生率と死亡率を減らすためのマイルストーンと目標を達成するために不可欠です1。
従来の培養方法や表現型薬物感受性試験(pDST)に頼ると、臨床分離株の耐性プロファイルの決定が遅れ、所要時間は6〜8週間で、複雑な生物学的封じ込めインフラストラクチャが必要になります。定期的な診断検査とDR-TBのNGSを組み合わせることで、包括的な薬剤耐性プロファイルを提供し、MDR-TBレジメンの個別化を改善すると同時に、効果的な治療までの時間を数週間または数か月から2、3、4日に短縮することができます。
2023年と2024年に、WHOは、第一選択薬と第二選択薬の抗結核薬に対する感受性を迅速に判断するための新しい診断クラスとしてtNGSの使用を推奨しました5。これにより、バイオセーフティレベル3(BSL-3)の研究室で 結核菌 (MTB)の培養を必要とせずに、治療の決定を導くための貴重なツールとなります。tNGSアプローチは、シーケンシングの前にポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を使用して薬剤耐性を付与する遺伝子標的を増幅するシーケンシングの凝縮された形式です。WHOが推奨するtNGS検査の中から、リファンピシン、イソニアジド、エタンブトール、ピラジナミド、フルオロキノロン、アミカシン、ストレプトマイシン、リネゾリド、ベダキリン、クロファジミンに対する耐性を検出するためのクラスベースの基準を満たすと報告されているDeeplex Myc-TBアッセイを選択しました。このアッセイを使用して、このプロトコルを使用して抽出したDNAの下流tNGSへの適合性を評価します。
さらに、WHOは、MTBにおける薬剤耐性に関連する変異のカタログの第2版を発行し 、全ゲノムシーケンシング(WGS)とtNGSを使用して薬剤感受性を予測し、治療を導くためのロードマップを提供しています6。最近のシステマティックレビューとメタアナリシスでは、tNGSは、pDST7と比較して、MTBゲノムのさまざまな耐性付与領域の23の標的に基づいて、薬剤耐性の検出に対してそれぞれ94.1%と98.1%の感度と特異性を持っていたことが示されました。
しかし、これらの手法の実装は、特に必要なワークフロー、インフラストラクチャ、および機器に関連する複雑さとコストのために、依然として困難です。重要な課題は、除染された喀痰の沈殿物から十分な高品質のマイコバクテリアDNAを直接単離することであり、これは下流のtNGSアプリケーションにとって重要なステップです。これに対処するために、tNGSに合わせた迅速で簡単なDNA抽出法を紹介します。
選択されたMTB tNGSアッセイの標準化されたDNA抽出法には、社内の手動および自動プロトコール8が含まれています。ここでは、簡略化されたマトリックスベースのDNA抽出プロトコルについて説明します(図1)。この方法では、金属とタンパク質を結合するInstaGene Matrix(IGM)を利用し、除染された喀痰沈殿物から直接高品質の核酸抽出を可能にします。この代替手段は、より迅速なターンアラウンドタイムと、ダウンストリームのtNGSに対する十分なDNA収量を提供します。このプロトコルは、手動および自動の方法の複雑さを克服しながら、MTBに耐性を与えるバリアントの迅速な診断のための高品質のtNGSを確保します。マイコバクテリア学分野でのtNGSの使用への関心が高まる中、このプロトコルは日常的な診断ワークフローへの採用を促進する可能性があります。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68147/68147fig01.jpg"> 
図1:マトリックス懸濁液を使用して除染された喀痰沈殿物サンプルからマイコバクテリアDNAを抽出する方法の概略図。 この <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68147/68147fig01large.jpg" target="_blank">図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

<table><tbody><tr><td>代替案: ベンチマーク BeadBlaster 24</td><td>ベンチマークサイエンティフィック</td><td>D2400</td><td></td></tr><tr><td>AMPure XP ビーズベース試薬</td><td>ベックマン・コールター</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>オートクレーブ滅菌または滅菌ガラスビーズ(2 mm)</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>Z273627-1個</td><td></td></tr><tr><td>エチルアルコール、ピュア&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>E7023-500ML型</td><td></td></tr><tr><td>フィルターピペットチップ(10&micro;L)</td><td>バイオスマート科学</td><td>FT-10-R</td><td></td></tr><tr><td>フィルターピペットチップ(1000&micro;L)</td><td>バイオスマート科学</td><td>FT1000-R</td><td></td></tr><tr><td>フィルターピペットチップ(20&micro;l)</td><td>バイオスマート科学</td><td>FT20-R</td><td></td></tr><tr><td>フィルターピペットチップ(200&micro;L)</td><td>バイオスマート科学</td><td>FT200-R</td><td></td></tr><tr><td>37°Cの範囲の加熱ブロック。Cから100&deg;C&nbsp;</td><td>エッペンドルフ</td><td>5382000031</td><td></td></tr><tr><td>高速ホモジナイザー(HSM)as FastPrep-24</td><td>MPバイオメディカルズ</td><td>116005500</td><td></td></tr><tr><td>インキュベーター 80 &g;C</td><td>ラセックグループ</td><td>IBLPDHG-9030A</td><td></td></tr><tr><td>InstaGeneマトリックス</td><td>バイオ・ラッド・ラボラトリーズ株式会社</td><td>BBRD7326030</td><td></td></tr><tr><td>低結合マイクロチューブ(1.5 mLまたは2 mL)</td><td>エッペンドルフ</td><td>EP0030108051-250EA</td><td></td></tr><tr><td>1.5 &ndash 用の磁気ラック。2 mLチューブ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>マグネチックスターラー</td><td>メルク</td><td>Z671886</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ遠心分離機</td><td>エッペンドルフ</td><td>5406000046</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q IX 7015 純水浄化システム</td><td>メルク</td><td>ZIX7015T0C</td><td></td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリー水(NFW)、分子グレード</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>ピペット(P10、P20、P200、P1000)</td><td>エッペンドルフ</td><td>EP3123000918-1個</td><td></td></tr><tr><td>量子ビットアッセイチューブ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社</td><td>質問32856</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HSアッセイキット</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社</td><td>質問33231</td><td></td></tr><tr><td>Qubit蛍光光度計装置</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社</td><td>Q33226</td><td></td></tr><tr><td>スクリューキャップチューブ(1.5mL)</td><td>株式会社サイエンティフィックスペシャリティ</td><td>P2TUB056C-0001.5ST</td><td></td></tr><tr><td>渦動</td><td>ラセックグループ</td><td>WMBB0L0E0216</td><td></td></tr></tbody></table>

除染された喀痰サンプルの標的次世代シーケンシングのためのマトリックスベースのdna抽出

Matrix-based DNA Extraction for Targeted Next-Generation Sequencing on Decontaminated Sputum Samples

サンプルの説明 細菌負荷が少なくとも1+の顕微鏡検査で酸耐性菌(AFB)陽性の合計165の喀痰沈殿物サンプルは、南アフリカのケープタウンにある国立衛生研究所サービス(NHLS)グリーンポイントによって定期的に収集および処理されました。DNAは、2つの異なる容量[約2 mL(n = 102)と500 μL(n = 63)]を使用して、喀痰沈殿物サンプルから抽出しました。この比較は、堆積物サンプルの量が少ないほど、下流のtNGSに十分なDNAを得られるかどうかを評価するために行われました。
図4は、さまざまな喀痰塗抹グレード(1+、2+、および3+)および喀痰沈殿物量(2 mLおよび500 μL)にわたる総DNA濃度(ng/μL)の箱ひげ図比較を示しています。DNA収量は、抽出に500 μLの沈殿物を使用すると、一般に全体的に減少し、塗抹グレードによってばらつきがあります。したがって、少なくとも2 mLの容量の沈殿物サンプルから抽出された平均DNA濃度は、サンプルのAFBによって層別化された500 μLの沈殿物から抽出されたDNA濃度よりも平均して高かった。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68147/68147fig04.jpg"> 
図4:塗抹グレード全体のDNA収量に対する喀痰沈殿物量の影響。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68147/68147fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
図 5 は、2 つの異なるインプット容量 (2 mL と 500 μL) から処理されたさまざまな塗抹グレード (1+、2+、3+) の喀痰沈殿物サンプルのすべてのターゲットの平均シーケンシングリード数 (平均カバレッジ深度) を示す箱ひげ図を示しています。外れ値は個々のポイントで表され、Y 軸はカバレッジの変動に対応するために対数スケールで表示されます。500 μL の沈殿物から抽出された 3+ サンプルの四分位範囲が高いことは、細菌負荷が高いほど変動性が大きくなることを示唆しています。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68147/68147fig05.jpg"> 
図5:塗抹標本グレードとサンプルインプット量にわたるすべてのターゲットの平均シーケンシングリード数(カバレッジ深度)の比較。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68147/68147fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
図6は、関連するWebアプリケーションのバイオインフォマティクスパイプラインを使用したシーケンシング結果の受容性の評価を示しています。シーケンシング品質スコアは、+++ (非常に許容可能)、++ (許容可能)、+ (わずかに許容可能)、-(許容できない)、および ND (未決定) に分類されます。グラフにバーがない場合は、その特定のカテゴリの結果が得られなかったことを示します。塗抹グレード1+は、500μLのインプットボリュームサンプルセットについて、塗抹グレード2+および3+と比較して、許容できない結果とND結果の割合が高いことを示しています。500 μL の喀痰沈底物から抽出したサンプルの平均シーケンシングカバレッジ深度は 4,316 であったのに対し、2 mL の喀痰沈殿物から抽出したサンプルの平均シーケンシングカバレッジ深度は 4,810 でした。このことは、喀痰沈底物から抽出されたDNAが、インプット量に関係なく、下流のtNGSを行うのに適切であったことを示唆しています。
シーケンシング結果の受容性の分布に基づくと、塗抹グレードが3+のサンプルは、1+および2+の塗抹グレードのサンプルと比較して、ほとんどのサンプル配列が++および+++としてスコアリングされ、成功率が最も高かった。500 μL インプットサンプルの場合、- および + カテゴリーのサンプルの割合は、2 mL インプットサンプルと比較して、すべての塗抹グレードで相対的に高くなっています。これは、500 μL インプットのサンプルが低品質で許容範囲が狭いカテゴリに分類されることを示唆しています。2 mL インプットサンプルでは、特に塗抹グレード 3+ の場合、高品質の ++ および +++ カテゴリーのサンプルの割合が高くなります。このことから、2 mL インプットのサンプルは、500 μL インプットのサンプルと比較して、シーケンシング品質スコアが良好である可能性が高いことが示唆されています。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68147/68147fig06.jpg"> 
図6:塗抹グレードとサンプル入力量による品質スコアの分布。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68147/68147fig06large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

除染された喀痰サンプルの標的次世代シーケンシングのためのマトリックスベースのDNA抽出

Next-generation sequencing (NGS) is now recognized as a powerful tool for timely and accurate drug-resistant tuberculosis (DR-TB) diagnosis. Targeted NGS ...

私たちの研究は、個別化された患者ケアに NGS を組み込むことにより、結核の診断とその後の開始の所要時間を短縮することです。当社のプロトコルは、ワークフローの統合、コスト、所要時間に対処することで、日常的な使用のためにTNGSを最適化し、診断の遅延を減らし、タイムリーな治療開始を改善することを目的としています。このプロトコルにより、最大 3 日かかる従来の CTAB 法と比較して、数時間以内に臨床サンプルから費用対効果が高く、迅速かつ十分な品質の DNA を抽出できます。私たちの結果は、TNGSを日常的な診断に統合し、感度と臨床的有用性を向上させるための塗抹標本陰性および乏しいサンプルの抽出方法の最適化に関する重要な疑問を提起します。結核ゲノム監視を合理化および拡大するための喀痰の直接全ゲノム配列決定を含む、日常的な診断からの残骸サンプルを下流の配列決定に使用できるかどうかを調査します。[ナレーター]まず、熱不活化された喀痰沈殿物を取得します。サンプルを16,800 G、または全速力で15分間遠心分離します。20〜200マイクロリットルのピペットを使用して、ペレットが乱れないように、上清を穏やかに吸引して廃棄します。マトリックス懸濁液を軽く振って混合し、よく混合したマトリックス200マイクロリットルをピペットでピペットで混ぜてペレットを再懸濁します。直径2ミリメートルの滅菌済みガラスビーズを3個入った1.5ミリリットルのスクリューキャップチューブに全容量を移します。次に、サンプルを摂氏56度の加熱ブロックに15分間置きます。インキュベーション後、サンプルをボルテックスで10秒間均質化して細胞を分散させ、サンプルを摂氏100度の加熱ブロックで10分間インキュベートします。高速ホモジナイザーを使用して、毎秒4.0メートルで60秒の1サイクルでサンプルを均質化します。次に、懸濁液を12,000 Gで5分間遠心分離します。130マイクロリットルのDNA含有上清を、ペレットを乱すことなく、新鮮な1.5ミリリットルの低結合チューブに移します。マトリックスと細胞の破片を含む最初のチューブを廃棄します。磁気ビーズを使用してDNAを精製するには、まず磁気ビーズストックボトルまたは調製したアリコートをボルテックスして使用前にビーズを再懸濁させ、次に抽出したDNAに1.2倍の体積の磁気ビーズを加え、懸濁液を10回ピペットで試料を混合してから、室温で5分間インキュベートします。サンプルを1.5ミリリットルのチューブ磁気ラックに3分間、または液体が透明になるまで置き、ビーズを乱さずに慎重に上清を吸引して廃棄します。チューブを磁石に乗せて、200 マイクロリットルの 80% エタノールを加え、ビーズが乱れないようにします。30秒間のインキュベーション後、ビーズを乱さずにエタノールを慎重に吸引して廃棄します。2回目の洗浄後、1〜10マイクロリットルのピペットを使用して残留エタノールを取り除きます。チューブを開いたままにして、ビーズを10分間、またはマットな外観になるまで自然乾燥させます。ビーズがつや消しの外観になったら、磁石からチューブを取り外し、各サンプルのビーズに50マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水を直接加えます。次に、ピペッティングして個々のサンプルを10回混合します。チューブにビーズが詰まっていないか検査します。室温で5分間インキュベートした後、チューブを磁気ラックに3分間、または液体が透明になるまで戻します。チューブを磁気ラックに置いて、DNAを含む上清を明確にマークされた滅菌低結合チューブに移します。DNA濃度は、すべての塗抹標本グレードで500マイクロリットルと比較して、2ミリリットルの沈殿物サンプルで高かった。DNA収量の大きなばらつきは、500マイクロリットルの堆積物サンプルで観察されました。シーケンシングリードのカバレッジ深度は、すべての塗抹標本グレードで500マイクロリットルと比較して、2ミリリットルの堆積物サンプルで高かった。変動性は、500マイクロリットルの堆積物から抽出された3つの塗抹標本グレードのサンプルでより大きかった。シーケンシングの受容性スコアは、一般に500マイクロリットルと比較して2ミリリットルのサンプルで高く、非常に許容できる結果の割合が高くなりました。塗抹標本グレード3プラスおよび2プラスと比較して、許容可能な結果の割合が最も高かった。500マイクロリットルのサンプルでは、許容できない、または決定されていないと分類された症例が多かった。

matrix-based-dna-extraction-for-targeted-next-generation-sequencing

Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

初期生活ストレスにDNAメチル化と遺伝子発現の変化を研究するために合理化されたワークフローが表示されます。新生児マウスと離散の脳組織の分離の母子分離から始めて、我々は同時に、その後の重亜硫酸塩シークエンシングおよびRT-PCR解析のための脳組織のパンチからDNAとRNAを単離するためのプロトコルを表します。...

脳の小、解剖学的に定義された領域からのDNAメチル化と遺伝子発現の最適化分析

説明は簡単で、密度に依存しない濃縮のためのビオチンリンカーを転送するために、クリックケミストリー、続いて5-HMCにアジド-グルコースを転送するために、β-グルコシルトランスフェラーゼ（β-GT）を用いた二段階ラベリングプロセスである。この効率的で特異的標識法は、次世代シーケンシングを介して非常に低いバックグラウンドと高いスループットepigenomicマッピングで5-HMCの濃縮を可能にします。...

ゲノムDNAから5  - ヒドロキシの選択的捕獲

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次世代シーケンシングのための収集と唾液DNAの抽出

NGSシーケンシングのためのgDNA濃縮は、体質的突然変異の研究のための簡単で強力なツールです。この記事では、DNA損傷修復に関与する11個の遺伝子の完全な配列を簡単に解析する手順を紹介します。...

の全配列のNGS解析のためのトランスポゼースベースの技術によるgDNAのエンリッチメント BRCA1 BRCA2、およびDNA損傷修復に関与する遺伝子9

例として、嚢胞性線維症の気道を使用すると、原稿は、動物関連のサンプル中の微生物およびウイルスのコミュニティを特徴づけるためにメタゲノムとmetatranscriptomicアプローチの組み合わせを含む総合的なワークフローを提供します。...

複雑な動物に関連したサンプルからのシーケンシングメタゲノムとMetatranscriptomes：不純を精製する

Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencingは、制限酵素消化とシトシンバイサルファイト変換を組み合わせたDNAメチル化解析のためのシーケンシングライブラリを調製する方法です。このプロトコルでは、50...

塩基対解像度でDNAメチル化の評価のための強化されたの減少表現重亜硫酸塩シークエンシング

次世代シーケンシングによりDNAメチル化解析をターゲット

ここでは、メチルDNA結合キャプチャシーケンシング（MBDCap-seqのかMBD-seqの）技術とその後のバイオインフォマティクス解析パイプラインを使用して大規模な臨床患者スクリーニング研究におけるゲノムワイドDNAメチル化を調査するためのプロトコルを提示します。...

患者の組織のためのメチル結合DNA捕捉シーケンシング

ここでは、自由に利用可能なツールを使用して16S...

2段階PCRと次世代16S rRNA遺伝子シーケンシングを用いての微生物叢解析

ここで説明するDNA抽出プロトコルは、蚊から高品質のDNA抽出を生成するために磁気ビーズを使用する。これらの抽出は、下流の次世代シーケンシングアプローチに適しています。...

次世代シーケンシングのための磁気ビーズベースの蚊DNA抽出プロトコル

このプロトコルは、DNAキャプチャビーズ精製と組み合わせたビーズビード精製により、 結核菌...

カスタムバッファーでのビーズビーティングとそれに続く NGS ワークフローを使用したマイコバクテリア DNA 抽出

学ぶマトリックスベースDNA抽出法で除染喀痰からMycobacterium tuberculosisの標的次世代シーケンシングを実施する方法。磁気ビーズ精製によりDNA収量と純度を向上させ、臨床診断と研究応用に有用な再現性の高いプロトコルを提供します。

除染された喀痰サンプルの標的次世代シーケンシングのためのマトリックスベースのDNA抽出

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