除染された喀痰サンプルの標的次世代シーケンシングのためのマトリックスベースのDNA抽出

私たちの研究は、個別化された患者ケアに NGS を組み込むことにより、結核の診断とその後の開始の所要時間を短縮することです。当社のプロトコルは、ワークフローの統合、コスト、所要時間に対処することで、日常的な使用のためにTNGSを最適化し、診断の遅延を減らし、タイムリーな治療開始を改善することを目的としています。

このプロトコルにより、最大 3 日かかる従来の CTAB 法と比較して、数時間以内に臨床サンプルから費用対効果が高く、迅速かつ十分な品質の DNA を抽出できます。

私たちの結果は、TNGSを日常的な診断に統合し、感度と臨床的有用性を向上させるための塗抹標本陰性および乏しいサンプルの抽出方法の最適化に関する重要な疑問を提起します。結核ゲノム監視を合理化および拡大するための喀痰の直接全ゲノム配列決定を含む、日常的な診断からの残骸サンプルを下流の配列決定に使用できるかどうかを調査します。

[ナレーター]まず、熱不活化された喀痰沈殿物を取得します。サンプルを16,800 G、または全速力で15分間遠心分離します。20〜200マイクロリットルのピペットを使用して、ペレットが乱れないように、上清を穏やかに吸引して廃棄します。マトリックス懸濁液を軽く振って混合し、よく混合したマトリックス200マイクロリットルをピペットでピペットで混ぜてペレットを再懸濁します。直径2ミリメートルの滅菌済みガラスビーズを3個入った1.5ミリリットルのスクリューキャップチューブに全容量を移します。次に、サンプルを摂氏56度の加熱ブロックに15分間置きます。インキュベーション後、サンプルをボルテックスで10秒間均質化して細胞を分散させ、サンプルを摂氏100度の加熱ブロックで10分間インキュベートします。高速ホモジナイザーを使用して、毎秒4.0メートルで60秒の1サイクルでサンプルを均質化します。次に、懸濁液を12,000 Gで5分間遠心分離します。130マイクロリットルのDNA含有上清を、ペレットを乱すことなく、新鮮な1.5ミリリットルの低結合チューブに移します。マトリックスと細胞の破片を含む最初のチューブを廃棄します。磁気ビーズを使用してDNAを精製するには、まず磁気ビーズストックボトルまたは調製したアリコートをボルテックスして使用前にビーズを再懸濁させ、次に抽出したDNAに1.2倍の体積の磁気ビーズを加え、懸濁液を10回ピペットで試料を混合してから、室温で5分間インキュベートします。サンプルを1.5ミリリットルのチューブ磁気ラックに3分間、または液体が透明になるまで置き、ビーズを乱さずに慎重に上清を吸引して廃棄します。チューブを磁石に乗せて、200 マイクロリットルの 80% エタノールを加え、ビーズが乱れないようにします。30秒間のインキュベーション後、ビーズを乱さずにエタノールを慎重に吸引して廃棄します。2回目の洗浄後、1〜10マイクロリットルのピペットを使用して残留エタノールを取り除きます。チューブを開いたままにして、ビーズを10分間、またはマットな外観になるまで自然乾燥させます。ビーズがつや消しの外観になったら、磁石からチューブを取り外し、各サンプルのビーズに50マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水を直接加えます。次に、ピペッティングして個々のサンプルを10回混合します。チューブにビーズが詰まっていないか検査します。室温で5分間インキュベートした後、チューブを磁気ラックに3分間、または液体が透明になるまで戻します。チューブを磁気ラックに置いて、DNAを含む上清を明確にマークされた滅菌低結合チューブに移します。DNA濃度は、すべての塗抹標本グレードで500マイクロリットルと比較して、2ミリリットルの沈殿物サンプルで高かった。DNA収量の大きなばらつきは、500マイクロリットルの堆積物サンプルで観察されました。シーケンシングリードのカバレッジ深度は、すべての塗抹標本グレードで500マイクロリットルと比較して、2ミリリットルの堆積物サンプルで高かった。変動性は、500マイクロリットルの堆積物から抽出された3つの塗抹標本グレードのサンプルでより大きかった。シーケンシングの受容性スコアは、一般に500マイクロリットルと比較して2ミリリットルのサンプルで高く、非常に許容できる結果の割合が高くなりました。塗抹標本グレード3プラスおよび2プラスと比較して、許容可能な結果の割合が最も高かった。500マイクロリットルのサンプルでは、許容できない、または決定されていないと分類された症例が多かった。