正常組織から癌組織への進行をモデル化する食道オルガノイドの樹立と組織学的解析
2025年5月30日
本プロトコルは、腫瘍進行のさまざまな段階を表す食道オルガノイドモデルの確立と組織学的分析について説明しています。この方法により、研究者は、正常組織からがん組織への移行中の細胞形態、空間構成、および分子マーカー発現パターンの変化を研究することができます。
私たちの研究は、腫瘍の発生と初期の腫瘍形成に焦点を当てています。正常細胞がどのように腫瘍細胞に形質転換するか、そしてこれらの細胞が腫瘍形成を促進するために微小環境をどのように変化させるかを調べます。現在、幹細胞技術、遺伝子編集技術、高度な3D培養システムや生体材料、単一細胞・空間オミクス技術など、研究の推進に用いられる技術は数多くあります。私たちが直面している最大の課題は、オルガノイドを細菌や真菌から守ることです。これらの汚染物質は組織の取り扱いや輸送中に忍び込み、多くの場合、私たちの培養物を台無しにします。
[講師]まず、基底膜マトリックスとヒト食道オルガノイド培地を摂氏4度で解凍します。組織サンプルを5ミリリットルの遠心分離管に移し、室温の洗浄バッファーでサンプルを3回洗浄します。滅菌ハサミを使用して、組織を1.5ミリリットルの遠心分離管で1ミリメートルの立方体に切り刻みます。次に、組織断片を1ミリリットルの消化バッファーに懸濁します。混合物を摂氏37度で毎分50〜100回転で10〜20分間振とうと、組織を消化します。次に、混合物を400Gで摂氏4度で5分間遠心分離します。次に、上清を捨てます。ペレットを500マイクロリットルの0.025%トリプシン-EDTAに再懸濁します。懸濁液を摂氏37度で10分間インキュベートします。次に、10%ウシ胎児血清を添加した1ミリリットルのDMEMを加えて、酵素活性を停止します。次に、懸濁液を 70 マイクロメートルの滅菌フィルターに通し、濾液を 1.5 ミリリットルの遠心分離管に集めます。濾液を摂氏4度で400Gで5分間遠心分離します。上清を廃棄した後、細胞を100マイクロリットルのH-EOCMに再懸濁します。細胞を再懸濁した後、セルカウンターを使用して細胞密度を測定します。次に、1ミリリットルあたり5,000〜15,000個の細胞を新しい1.5ミリリットルのチューブに移します。オルガノイド播種の場合は、細胞を50〜100マイクロリットルの基底膜マトリックスに穏やかに再懸濁します。50マイクロリットルのマトリックスセル混合物を24ウェルプレートの各ウェルの中心にピペットで移動させます。摂氏37度で30分間インキュベートして、基底膜マトリックスを重合させます。次に、500マイクロリットルの予熱H-EOCMを各ウェルにピペットで移動させ、マトリックスを覆います。次に、プレートを摂氏37度で5%二酸化炭素を含む加湿インキュベーターでインキュベートします。培地を交換するには、使用済み培地を吸引します。摂氏37度に予熱した500マイクロリットルの新鮮なH-EOCMを各ウェルに補充します。再パラフィン化および再水和したオルガノイドに対してマルチプレックス免疫蛍光染色を行う。ヒツジ血清ブロッキング溶液を加えて、湿度チャンバーに入れたスライド上のオルガノイドを覆い、スライドを室温で30分間インキュベートします。PBS含有トゥイーンでスライドを2分間洗浄します。次に、希釈した一次抗体を滴下してオルガノイド領域を覆います。抗体の要件に従って湿度チャンバーでインキュベートします。インキュベーション後、スライドをPBS-T中で2回、80 PMMで2分間洗浄します。次に、二次抗体溶液をオルガノイド領域に滴下し、室温の湿度チャンバーで20分間インキュベートします。インキュベーション後、スライドをPBS-T中で2回、熱安定性チャンバー内で80 RPMで2分間洗浄します。洗浄したスライドの上に蛍光色素溶液をピペットでかけ、オルガノイド領域を覆い、再度インキュベートします。インキュベーション後、スライドをPBS-Tで2回洗浄します。マルチ染色の場合は、抗原回収と抗体ブロッキングを繰り返します。次に、オルガノイド領域を覆うためにダッピー溶液を滴下します。スライドを滅菌水に2分間浸し、余分な汚れを洗い流します。デジタル画像を取得する前に、退色防止封入剤を追加し、カバースリップを適用します。オルガノイド構造は、KRT6A染色によって視覚化されるように、正常段階から癌段階までますます無秩序になりました。PDL1の発現は正常食道粘膜から食道扁平上皮癌へと徐々に増加した
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概要
本プロトコールでは、腫瘍進行のさまざまな段階を反映した食道オルガノイドモデルの構築および組織学的解析について概説します。これにより、正常組織から癌組織に至るまでの細胞形態、空間的配置、および分子マーカーの発現変化を研究することが可能になります。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 腫瘍学
- 細胞生物学
背景
- 研究は腫瘍の発生および初期腫瘍形成に焦点を当てています。
- 正常細胞は腫瘍細胞へと形質転換し、その微小環境を変化させます。
- 幹細胞、ゲノム編集、および3D培養システムなどの技術を用いています。
- 組織操作においては、細菌や真菌による汚染が課題となります。
研究の目的
- 腫瘍の進行を研究するためのオルガノイドモデルを構築すること。
- 腫瘍発生過程における細胞および分子特性の変化を分析すること。
- 正常組織からがん組織への移行に関する知見を提供すること。
使用方法
- 基底膜マトリックスおよび培地の融解。
- 組織サンプルの洗浄および消化によるオルガノイド培養の作製。
- 組織学的解析のための多重免疫蛍光染色。
- オルガノイドの構造および分子発現の変化のモニタリング。
主な結果
- オルガノイド構造は、正常から癌化段階に進むにつれて脱組織化が進んでいることが示された。
- KRT6A染色により、形態学的変化が可視化された。
- PDL1の発現は、正常組織から癌組織にかけて段階的に増加した。
- コンタミネーションのないオルガノイド培養の構築に成功した。
結論
- 本プロトコルにより、食道腫瘍の進行に関する詳細な研究が可能になります。
- 組織学的解析により、腫瘍形成過程における細胞変化についての知見が得られます。
- オルガノイドモデルは、がん生物学を理解する上で非常に有用です。
よくある質問
業界における実用的意義
ヒト食道オルガノイドモデルを用いることで、バイオファーマチームは正常状態から癌化への細胞および分子レベルの移行を解析することが可能となり、初期の腫瘍学研究における予測精度の向上が期待できます。空間的な構造およびバイオマーカー発現の定量的組織学的解析は、パイプラインの重要な転換点において、ターゲットの検証およびメカニズム面の低リスク化に寄与します。これらのモデルは、基礎生物学的発見と治療仮説の前臨床評価を橋渡しすることで、トランスレーショナルな連続性を促進します。
バイオ医薬品R&Dにおける戦略的応用
初期創薬およびターゲットバリデーション
- 腫瘍形成経路および細胞形質転換イベントの体系的な解析を可能にします。
- 空間的および分子的なバイオマーカー解析を通じて、候補ターゲットの機能的な検証をサポートします。
- 制御された3Dシステムで疾患の進行をモデル化することで、メカニズムに基づいたリスク低減を実現します。
- ステージ特異的な分子変化を明らかにすることで、ポートフォリオの優先順位付けを促進します。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 下流の化合物スクリーニングおよび表現型アッセイに向けた、バリデート済みオルガノイドシステムを構築します。
- 組織学的および免疫蛍光的なリードアウトを標準化し、再現性のある定量的な出力を得ることができます。
- 腫瘍ステージにおけるバイオマーカー発現の、スケーラブルでマルチプレックスな解析を可能にします。
- 疾患に関連したコンテキストにおける治療的介入の信頼性の高い評価を支援します。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- オルガノイド由来のバイオマーカーの変化を、前臨床研究のトランスレーショナルエンドポイントと整合させる。
- 腫瘍の進行をモデル化することにより、発見から前臨床検証までの連続性を維持する。
- 定量的な分子および形態学的データに基づき、リスク調整済みの進展決定に情報を供する。
- 食道がんパスウェイを標的とした候補療法の予測的なリスク低減を実現する。
パイプラインおよびワークフローの統合
このオルガノイド・プロトコルは、初期のターゲット検証から前臨床研究に至るオンコロジー創薬の連続的なプロセスに統合され、反復的な仮説検証およびバイオマーカーに基づく意思決定を可能にします。
- 探索生物学：空間的および分子的な解析を用いて、腫瘍の発生と進行に関する仮説検証をサポートします。
- スクリーニング：アッセイ開発のために、再現性のある定量的な組織学的および免疫蛍光出力を提供します。
- アナリティクス：条件間の比較解析のために、デジタルイメージングおよびマルチプレックスバイオマーカー測定を提供します。
- トランスレーショナルリサーチ：探索的な知見を、前臨床バイオマーカーの整合性および疾患モデリングへとつなげます。
- エンタープライズ再利用：さまざまな腫瘍ステージや介入研究に適応可能な、再利用可能なオルガノイドプラットフォームを確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： ターゲットバリデーションにおける予測の信頼性を高め、メカニズムの曖昧さを低減します。
- 運用的価値： オルガノイドの培養、染色、およびイメージングのワークフローを標準化し、再現性と拡張性を確保します。
- 戦略的価値： オンコロジー研究開発における、情報に基づいた意思決定（go/no-go判断）と資本効率の高いポートフォリオ管理を可能にします。
- ポートフォリオへの影響： 食道がんを標的とする治療薬候補のリスク調整済み優先順位付けと推進をサポートします。
実施上の考慮事項
- 3D細胞培養、組織学、および免疫蛍光染色の技術に関する専門知識が必要です。
- 無菌的な組織操作、高度なイメージング、および解析インフラへのアクセスが求められます。
- コンタミネーションを防ぎ、データの品質を確保するために、チーム間での厳格な標準化が必要です。
- 食道癌研究における異なる腫瘍ステージや分子標的に応じて適応可能です。
- 組織操作中のコンタミネーションのリスクという実用上の制限があるため、プロトコルの厳守が不可欠です。
