正常組織から癌組織への進行をモデル化する食道オルガノイドの樹立と組織学的解析

本プロトコルは、腫瘍進行のさまざまな段階を表す食道オルガノイドモデルの確立と組織学的分析について説明しています。この方法により、研究者は、正常組織からがん組織への移行中の細胞形態、空間構成、および分子マーカー発現パターンの変化を研究することができます。

私たちの研究は、腫瘍の発生と初期の腫瘍形成に焦点を当てています。正常細胞がどのように腫瘍細胞に形質転換するか、そしてこれらの細胞が腫瘍形成を促進するために微小環境をどのように変化させるかを調べます。現在、幹細胞技術、遺伝子編集技術、高度な3D培養システムや生体材料、単一細胞・空間オミクス技術など、研究の推進に用いられる技術は数多くあります。私たちが直面している最大の課題は、オルガノイドを細菌や真菌から守ることです。これらの汚染物質は組織の取り扱いや輸送中に忍び込み、多くの場合、私たちの培養物を台無しにします。

[講師]まず、基底膜マトリックスとヒト食道オルガノイド培地を摂氏4度で解凍します。組織サンプルを5ミリリットルの遠心分離管に移し、室温の洗浄バッファーでサンプルを3回洗浄します。滅菌ハサミを使用して、組織を1.5ミリリットルの遠心分離管で1ミリメートルの立方体に切り刻みます。次に、組織断片を1ミリリットルの消化バッファーに懸濁します。混合物を摂氏37度で毎分50〜100回転で10〜20分間振とうと、組織を消化します。次に、混合物を400Gで摂氏4度で5分間遠心分離します。次に、上清を捨てます。ペレットを500マイクロリットルの0.025%トリプシン-EDTAに再懸濁します。懸濁液を摂氏37度で10分間インキュベートします。次に、10%ウシ胎児血清を添加した1ミリリットルのDMEMを加えて、酵素活性を停止します。次に、懸濁液を 70 マイクロメートルの滅菌フィルターに通し、濾液を 1.5 ミリリットルの遠心分離管に集めます。濾液を摂氏4度で400Gで5分間遠心分離します。上清を廃棄した後、細胞を100マイクロリットルのH-EOCMに再懸濁します。細胞を再懸濁した後、セルカウンターを使用して細胞密度を測定します。次に、1ミリリットルあたり5,000〜15,000個の細胞を新しい1.5ミリリットルのチューブに移します。オルガノイド播種の場合は、細胞を50〜100マイクロリットルの基底膜マトリックスに穏やかに再懸濁します。50マイクロリットルのマトリックスセル混合物を24ウェルプレートの各ウェルの中心にピペットで移動させます。摂氏37度で30分間インキュベートして、基底膜マトリックスを重合させます。次に、500マイクロリットルの予熱H-EOCMを各ウェルにピペットで移動させ、マトリックスを覆います。次に、プレートを摂氏37度で5%二酸化炭素を含む加湿インキュベーターでインキュベートします。培地を交換するには、使用済み培地を吸引します。摂氏37度に予熱した500マイクロリットルの新鮮なH-EOCMを各ウェルに補充します。再パラフィン化および再水和したオルガノイドに対してマルチプレックス免疫蛍光染色を行う。ヒツジ血清ブロッキング溶液を加えて、湿度チャンバーに入れたスライド上のオルガノイドを覆い、スライドを室温で30分間インキュベートします。PBS含有トゥイーンでスライドを2分間洗浄します。次に、希釈した一次抗体を滴下してオルガノイド領域を覆います。抗体の要件に従って湿度チャンバーでインキュベートします。インキュベーション後、スライドをPBS-T中で2回、80 PMMで2分間洗浄します。次に、二次抗体溶液をオルガノイド領域に滴下し、室温の湿度チャンバーで20分間インキュベートします。インキュベーション後、スライドをPBS-T中で2回、熱安定性チャンバー内で80 RPMで2分間洗浄します。洗浄したスライドの上に蛍光色素溶液をピペットでかけ、オルガノイド領域を覆い、再度インキュベートします。インキュベーション後、スライドをPBS-Tで2回洗浄します。マルチ染色の場合は、抗原回収と抗体ブロッキングを繰り返します。次に、オルガノイド領域を覆うためにダッピー溶液を滴下します。スライドを滅菌水に2分間浸し、余分な汚れを洗い流します。デジタル画像を取得する前に、退色防止封入剤を追加し、カバースリップを適用します。オルガノイド構造は、KRT6A染色によって視覚化されるように、正常段階から癌段階までますます無秩序になりました。PDL1の発現は正常食道粘膜から食道扁平上皮癌へと徐々に増加した