顔面 高次元空間分子解析のためのマウス網膜の凍結切片

網膜は、ニューロンの計算を理解するための有用なモデルです。これらの計算は、セルの特別な位置に依存します。しかし、これに関する包括的な地図はとらえどころのないままです。

過去10年間で、単一細胞配列決定により、網膜細胞型の明確な記述が提供されました。現在、空間トランスクリプトミクスは、これらの記述を無傷の組織で使用する新しい方法を提供します。空間トランスクリプトミクスを使用する際の重要な課題は、非常に薄い組織切片が必要であることです。網膜は、私たちが興味を持っている水平面ではすでにかなり薄いです。

この方法を発明して薄くて高速な切片を作成し、機械学習で空間トランスクリプトミクスを使用して、同じ組織内のすべての網膜神経節細胞をマッピングします。過去30年間で、マウスの網膜神経節細胞45匹のうち17匹しかマッピングされませんでしたが、この技術により、それらすべてを一度にマッピングすることができました。

[講師]まず、安楽死させたマウスを作業台に置きます。角膜上の地球の側頭極を走らせて、向きを維持し、解剖の弱点を作りました。地球儀を沈め、ろ紙の入った皿に溶液を照準します。鋭利な5番鉗子と虹彩はさみで、強膜に穴を開けることなく、すべての筋肉組織、筋膜、血管系、神経を地球から慎重に取り除きます。1つの虹彩はさみの刃の先端を角膜ブランドに対して垂直に配置します。この位置で地球に穴を開けます。角膜と輪部をきれいに切開し、強膜と網膜に向かって視神経乳頭に向かって進みます。次に、ブレードを最初のカットに対して垂直に、輪部から約1ミリメートル後方に配置します。強膜と網膜を放射状に切断し始めます。鋭利な鉗子を使用して地球儀をガイドおよび回転させることにより、輪部の後方と平行に一貫した切断線を維持します。網膜と強膜が分離している場合は、虹彩はさみの刃の位置を変更して一緒に切断します。虹彩はさみ刃の中間幅を使用して後方1ミリメートルの距離を推定します輪部に平行な放射状切断を完了したら、網膜接続が残っているかどうかを調べます。前眼球と後眼球の部分が分離するまで、虹彩はさみでこれらを慎重に切断します。次に、2組の鋭利な5番鉗子を使用して、地球の前部と後部をそっと分離します。高齢のマウスでは、透明な繊維が水晶体と網膜カップをつなぐ場合は、網膜強膜の分離を最小限に抑えながら、虹彩はさみで慎重に切断します。ろ紙を支持台として使用して、網膜をクローバーの葉に切り、アイリスハサミで鉄十字模様とも呼ばれます。2番目の目で解剖を繰り返します。使い捨てのプラスチックトランスファーピペットの先端を切断して、解剖された網膜と強膜よりも大きな開口部を作成します。網膜をピペットにそっと吸引し、ガラス顕微鏡スライドに堆積させます。実験室用ワイプを使用して、網膜が浮かなくなり、平らになるまで余分な照準液を取り除きます。次に、2 つの鋭利な 5 番鉗子を使用して網膜を広げ、内側のアイカップを上に向けて平らに配置します。各クローバーレリーフセグメントに0.5〜2ミリメートルの長さのレリーフカットを作成して、平らにし、折りたたまれないように調整します。網膜に隣接する液体を除いて、残りのエイム溶液をすべて取り除きます。カバースリップを使用して、網膜をすばやく押して移動し、外側の強膜が上を向き、内側のアイカップがカバースリップに接触するようにします。網膜が折りたたまれていないことを確認し、必要に応じて調整します。操作を補助するために照準液を追加しますが、カールを防ぐためにワイプで余分なものを取り除き、5〜10秒間自然乾燥させます。次に、OCT培地を網膜を覆うために塗布します。次に、鉗子を使用してカバースリップ全体に層を均一に広げ、浮遊を防ぎます。液体窒素蒸気で冷却した金属板を使用するか、ドライアイスに直接接触することにより、OCT培地中で網膜を瞬間凍結します。凍結した網膜はドライアイスの上に保管し、すぐに使用してください。凍結切片の場合は、同じクライオスタットモデルを使用する場合は、標本チャックにOCTドームを作成し、内側の2〜3個の環を占有します。試験片チャックを切断面に平らに合わせます。チャックとクライオスタットステージに関連する方向ガイドを作成するか、メモします。次に、ドームをトリミングして、ブレードと平行な平らな面を形成します。カミソリの刃で余分なOCTを横方向に取り除き、網膜をカバースリップから慎重に分離して可動性にします。ステージからチャックを取り外し、準備した平らなOCT表面に液体OCTを少量垂らします。次に、網膜を液体OCTに直接置きます。事前に冷却したスライドガラスを使用して、網膜を凍結するまで押し続けます。網膜とチャックにさらにOCTを塗布して、結合を確実にします。次に、クライオスタット急速凍結エリアでアセンブリを凍結します。切片化の場合は、網膜が見えるまで余分なOCTを慎重にトリミングします。 カミソリの刃を使用して、OCT ブロックの端を網膜の近くに成形します。強膜の有無を検査しながらトリミングを続けます。強膜が見える場合は、必要に応じてステージの角度を調整します。強膜がセクション全体にほぼ均等に分布している場合は、トリミングを中止します。次に、事前に冷却したスライドと 2 本のペイント ブラシを使用してセクションを操作し、収集します。OCTが溶けて組織がスライドに付着するまで、セクションの下に指を約5秒間置きます。次に、スライドを冷たい表面に戻して再凍結します。準備したスライドをドライアイスの上に保管して、すぐに使用してください。神経節細胞層における明確な免疫反応性またはRBPMSと、トマトレクチンで標識された血管叢の明確な分離により、網膜ラミネーションとタンパク質マーカーの保存に成功することが確認されました。12-plex RNA Scopeパネルを使用したマルチプレックスRNA検出では、空間構造を維持することに成功し、顔のスライス全体でGrm6やRBPMSなどのマーカーの明確な発現が明らかになりました。高解像度画像により、RBPMSやMafb6やMeis2などの他のマーカーの単一細胞発現パターンが確認され、神経節細胞層におけるタンパク質とRNAの両方の局在が検証されました。クローバーの葉切片全体に均一なシグナル分布とキセニウム空間トランスクリプトームデータにおける強いシグナルにより、ハイスループットプロファイリングとRNAの完全性が成功したことが確認されました。キセニウムを使用した単一細胞分解能の視覚化は、プラットフォーム間でプロトコルの堅牢性を確認する手動検出パターンに一致しました。細胞型特異的転写産物マーカーは、網膜断面積および顔マッピングで層状層流分布を示し、深さ全体でその位置を維持しました。神経節細胞層を詳細に拡大すると、DAPI核染色に対する正確な空間転写物検出が確認されました。