Name: 哺乳類胚のガラス化のためのスパチュラモンテビデオ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-06T15:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: 学ぶスパチュラモンテビデオ法によるマウスとヒツジの着床前胚ガラス化技術。自作スパチュラと凍結保護液を用いて液体窒素に急速浸漬し、高い生存率で胚を長期保存する再現性のある手法です。

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マウス胚を得るために使用された動物は、国内法18.611および国際動物管理ガイドライン11に従って飼育および取り扱われました。実験プロトコル(許可番号#007-18)は、モンテビデオ・パスツール研究所の動物管理・使用委員会によって適宜承認されました(書面による同意が得られました)。ヒツジの卵子/胚の実験プロトコルは、ARRIVEガイドライン12 に準拠し、国際動物管理ガイドライン11に従って実施された、Institutional Animal Care Committee Fundación IRAUy(プロトコル#001-2017)によって承認されました。
1. ガラス固化(図2)
<ol>
	<li>スパチュラMVDの準備<ol>
		<li>ゲルローダーチップ( 材料表を参照)を短くして、最初の10 mmとチップコーンを切り取ります。 注:これにより、先端が短くまっすぐになり、0.5mLストローによる最終的なシーリングが容易になります( 材料の表を参照)。</li>
		<li>ジェルローダーの先端を時計職人の#5鉗子(材料表を参照)で先端から約1.0cmのところに持ちます。先端をブンゼンバーナーの炎にそっと置き(材料の表を参照)、8〜10秒間保持して、約1mm2の花びらのようなプラットフォームを形成します。</li>
		<li>火から下ろし、鉗子で5秒間しっかりと保持します。</li>
		<li>実体顕微鏡( 材料の表を参照)を使用して、花びらのようなプラットフォーム(~1 mm2)が形成され、遠位端が密閉されていることを確認します。 注:ガラス化中のLN2 の浸潤を防ぐために、プラットフォームは遠位端で閉じる必要があります。プラットフォームが清潔で、プラスチックの糸がないことを確認してください。小さすぎる場合や糸がついている場合は、先端をトリミングして手順を繰り返します。</li>
		<li>手順1.1.1〜1.1.4を繰り返して、必要な数のヘラを準備します(1つのヘラ=最大40個のマウス胚)。</li>
		<li>紫外線(UV)またはエチレンオキシドを使用してスパチュラを滅菌し、滅菌チューブまたはボックスに保管します。</li>
		<li>ガラス化の日には、ヘラを取り出し、プラットフォームの反対側の端から扱います。識別ロッド( 材料の表を参照)を各ヘラに挿入し、実体顕微鏡ベースに置きます。ロッドに油性マーカーまたは液体窒素耐性ステッカーラベルを貼ります。 注意: へらを取り扱うときは、常にプラットフォームに触れないでください。完全なデバイス(ヘラ+ 0.5 mLストロー+識別ロッド)の全長は、ゴブレットの長さの1 cmを超えてはなりません。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>ガラス固化液の調製<ol>
		<li>FS溶液を調製する:1.5 gの密度勾配培地( 材料の表を参照)と0.85 gのスクロース( 材料の表を参照)を5 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS; 材料の表を参照)に溶解します。沸騰水浴で完全に溶解するまで加熱し、0.22 μmフィルターを使用して滅菌します( 材料の表を参照)。 注:この溶液は、4°Cで最大6ヶ月間保存できます。</li>
		<li>プレガラス化溶液(PV)を準備します:ガラス化の日に、10%エチレングリコール( 材料の表を参照)、10%のジメチルスルホキシド( 材料の表を参照)、および80%M2培地( 材料の表を参照)を混合します。5つのスパチュラに100μLの総容量が必要です。</li>
		<li>ガラス化溶液(V)を準備します:ガラス化の日に、15%エチレングリコール、15%ジメチルスルホキシド、10%M2培地、および60%FS溶液を組み合わせます。5回のスパチュラに合計100μLの容量が必要です。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>胚の脱水とガラス化プロセス<ol>
		<li>LN2の準備:LN2 を適切な容器(例:10 cm x 30 cm x 20 cmの断熱ポリスチレン容器)に注ぎ、使用するヘラと同じ数の0.5 mLストローを置きます。 注:LN2の下での操作中にスパチュラプラットフォームの視覚化を容易にするために、コントラスト効果を作成するために色付きの底部断熱ポリスチレン容器を使用することをお勧めします。 注意: LN2を取り扱うときは、適切なゴーグルと手袋(材料の表を参照)を着用してください。</li>
		<li>溶液の準備:100 mmのプラスチック製ペトリ皿( 材料の表を参照)に、各スパチュラに100 μLのM2、20 μLのPV溶液、および20 μLのV溶液を滴下します。</li>
		<li>胚のガラス化:ガラス化する胚をM2ドロップに入れます。一度に30〜40個の胚を取り扱い、PV溶液滴下で30秒間インキュベートし、次に室温(RT)でさらに30秒間V溶液滴下でインキュベートします。</li>
		<li>プルドガラスキャピラリー( 材料の表を参照)とアスピレーターチューブアセンブリ( 材料の表を参照)を使用します。胚を配置する前に、キャピラリーに少なくとも1 μLのそれぞれの溶液をプレロードします。 注:胚は液滴内で異なる高さにあるため、実体顕微鏡マイクロメーターを調整して胚を特定します。残り10秒で各ドロップから胚を回収します。すべての胚操作は実体顕微鏡下で行わなければなりません。</li>
		<li>胚をロードする:最小限のV溶液(~0.1 μLなど)を使用して胚を吸引し、スパチュラプラットフォームにすばやく配置します。</li>
		<li>LN2への浸漬:胚をロードした後、すぐにスパチュラプラットフォームをLN2 に5秒間浸します(スパチュラをロッドで手で保持します)。次に、ヘラをLN2 蒸気に保持しながら、長いステンレス鋼ピンセットを使用して0.5mLのストローで密封します( 材料の表を参照)。 注意: 温暖化中の膨張を防ぐために、密封する前にストローからLN2 を取り外してください。胚滴と藁壁が接触しないように、へらとわらが適切に位置合わせされていることを確認してください。便宜上、密封されたスパチュラは、すべてのスパチュラに胚がロードされるまでLN2 コンテナに残し、必要に応じてLN2 を補充することができます。</li>
		<li>手順を繰り返す:新しいPVドロップとVドロップのペアを使用して、胚の各グループに対してステップ1.3.3から1.3.7を繰り返します。</li>
		<li>保管:スパチュラをゴブレットに移し( 材料の表を参照)、次にLN2 ストレージデュワー( 材料の表を参照)に移します。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68176/68176fig02.jpg"> 
図2:スパチュラMVDを使用したガラス固化プロセスのスキーム。 詳細については、テキストを参照してください。BioRenderで作成。メイクル、M.(2025)https://BioRender.com/x96y902。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68176/68176fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
2. 温暖化(図3)
<ol>
	<li>溶液調製<ol>
		<li>1 Mショ糖溶液を調製し、0.85 gのスクロースを2.5 mLのM2培地に溶解します。0.22μmフィルターで溶液を滅菌します。 注:この溶液は調製し、4°Cで最大1週間保存できます。</li>
		<li>0.5 Mおよび0.25 Mのスクロース溶液を調製するには、1 Mのスクロース溶液を適切な容量のM2培地で希釈します。</li>
		<li>スクロース溶液をホットプレート( 材料表を参照)で温暖化が始まるまで37°Cに維持します。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>ウォーミングプレートの準備<ol>
		<li>100 mmのプラスチック製ペトリ皿に、温める各スパチュラに500 μLの0.5 Mスクロース、50 μLの0.5 Mスクロース、50 μLの0.25 Mスクロースを1滴ずつ溶液ドロップします。M2培地(各100μL)を3滴入れて洗浄します。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>温暖化プロセス 注:加温プロセスは、室温、例えば実体顕微鏡のベースで20〜22°Cで行われます。<ol>
		<li>デュワーから密封されたヘラを回収します。LN2 を使用して適切なコンテナに入れます。 図 3 を参照してください。</li>
		<li>ウォーミングプレートを実体顕微鏡に置きます。一度に1つずつ、ステンレス鋼のピンセットでヘラの基部を持ち、手袋をはめた手で識別ロッドを引き出し、次にストローを引き出します。胚を含むプラットフォームを500 μLの0.5 Mショ糖滴にすばやく浸します。</li>
		<li>すべての胚がドロップに落ちたことを確認します。必要に応じて、へらをそっと動かして放出を助けます。胚を引っ張ったガラスキャピラリーにロードし、0.5 Mショ糖溶液の50 μL滴下に入れ、2分間インキュベートします。</li>
		<li>胚を50 μL滴の0.25 Mショ糖溶液に入れ、さらに2分間インキュベートします。 注:胚を各溶液に入れる前に、使用する溶液をキャピラリーに事前にロードします。</li>
		<li>最後に、胚をM2培地の異なる滴で3回洗浄して、スクロースを取り除きます。</li>
		<li>使用前に、各種に適した条件下で胚を少なくとも1時間インキュベートします。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68176/68176fig03.jpg"> 
図3:スパチュラMVD温暖化プロセスのスキーム。詳細については、テキストを参照してください。 BioRenderで作成。メイクル、M.(2025)https://BioRender.com/k91k191。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68176/68176fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

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<li>Qiu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equilibrium+vitrification+of+mouse+embryos+using+low+concentrations+of+cryoprotectants%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Equilibrium vitrification of mouse embryos using low concentrations of cryoprotectants.</a> Cryobiology. 98, 127-133 (2021).</li>
<li>Tsang, W. H., Chow, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+mammalian+embryos%3A+Advancement+of+putting+life+on+hold%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Res+C+Embryo+Today%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of mammalian embryos: Advancement of putting life on hold.</a> Birth Defects Res C Embryo Today. 90 (3), 163-175 (2010).</li>
</ol>

遺伝子組み換え(GM)動物の作製効率は、エンドヌクレアーゼベースの方法、特にCRISPR/Cas9の開発により大幅に向上しました。世界中の多くの研究室では、遺伝的浮動を防ぎ、元の表現型1の完全性を維持するために凍結保存すべきさまざまなGMマウスおよびラット系統を製造しています。さらに、アーカイブ化により、動物の数が過剰になることが多い継続的な繁殖の必要性がなくなります。一部の研究室では、GMマウス系統を凍結保存された胚または精子として国際的なリポジトリに送っており、生きた動物の輸送を避けながらこれらのモデルの交換を促進しています。これにより、同一のGM動物モデルを繰り返し生成することなく、ラインへのアクセスが保証されます2。これらの理由から、胚と精子の凍結保存は、どのGM動物施設でも最優先事項です。一般に、胚は修飾された完全な二倍体ゲノムを含み、胚移植によって容易に回復できるため、GM系統の保存には胚凍結保存が好ましい。
ガラス化は、細胞に入る水と細胞の周りに細胞外結晶を形成する水との間の不均衡を特徴とする非平衡プロセスです。この方法は、細胞内の氷の結晶の形成を防ぎ、緩慢凍結法(SLF)3 ( 図1を参照)とは区別されます。高濃度の凍結保護剤と液体窒素(LN2)との直接接触により、超急速冷却(~40°C/s)が可能になり、数秒でサンプルのガラス質状態を達成できます。さらに、ガラス化は、ゆっくりと凍結する4よりも速く、簡単で、安価です。必要なLN2 は最小限で、通常は商用購入または自家製のシンプルな 機器を使用します5 ( 図1を参照)。
さらに、温暖化プロセスは一般的に高速で再現可能です。凍結保護剤の毒性を回避し、硝子体状態を維持するために迅速に実施する必要があります3。胚を凍結する際、多くの研究室では、キャリアデバイスの利便性、信頼性、堅牢性、保持能力、およびコストを考慮します。
私たちは、ヘラモンテビデオ(MVD)デバイス6を使用した、羊とマウスの胚の日常的な凍結保存のための最小容量のスパチュラガラス化法を好みます。当初は緩急凍結法7 を採用していましたが、すぐにガラス固化に移行しました。LN2 デュワー用のよりシンプルでスペース効率の高いデバイスを作成するために、クライオチューブに差し込むTsang and Chow(2009)8の自家製スパチュラを改造して、0.5 mLのストローで密封するスパチュラMVDを開発しました( 材料の表を参照)。スパチュラはゲルローダーチップ( 材料の表を参照)を備えており、細い鉗子で先端を穏やかに溶かすことにより約1mm²のプラットフォームが形成され、胚をロードするための花びらのようなプレートが作成されます。このプラットフォームは、小さなガラス化液滴で最大40個のマウス胚を収容できます。識別プラグロッド( 材料の表を参照)は、ゲルローダーチップの開放端に挿入されます。
この方法の目的は、胚を簡単、迅速、安価な方法でガラス化することであり、さらに窒素デュワーのスペースを節約することです。このシステムは長年にわたって成功裏に使用されており、特にマウス胚において、優れた胚生存率(~97%)と生殖結果をもたらしています。スパチュラMVDは実験室で作製するため、市販の装置9に比べて低コストな方法である。さらに、それはクライオチューブ8,10の使用と比較して窒素デュワーのスペースを節約する。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68176/68176fig01.jpg"> 
図1:胚の凍結保存に使用される主な2つの技術の比較。 この図は、Crispo et al.1 の許可を得て変更されています。BioRender.com 年に作成されました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68176/68176fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

<table><tbody><tr><td>0.22 & マイクロ;m フィルター&nbsp;</td><td>ザルトリウス</td><td>16534</td><td>ミニサートシリンジフィルター0.2&マイクロ;L</td></tr><tr><td>0.5mLストロー&nbsp;</td><td>ミニチューブ</td><td>13408/0044</td><td>フレンチタイプのミディアムパイエット</td></tr><tr><td>アスピレーターチューブアセンブリ&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>A5177</td><td></td></tr><tr><td>ブンゼンバーナー&nbsp;</td><td>インデュラブ</td><td>7000134</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>D2650型</td><td></td></tr><tr><td>エチレングリコール&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>102466</td><td></td></tr><tr><td>フィコルPM70&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>F2878</td><td>密度勾配媒体</td></tr><tr><td>ゲルローダーチップ</td><td>エッペンドルフ&nbsp;</td><td>10411193</td><td></td></tr><tr><td>ガラスキャピラリー&nbsp;</td><td>マリエンフェルト</td><td>2900000</td><td>マイクロヘマトクリット毛細血管</td></tr><tr><td>LN2ハンドリング用手袋&nbsp;</td><td>テンプシールド</td><td>セ0338</td><td>クライオグローブ</td></tr><tr><td>ゴブレット</td><td>ミニチューブ</td><td>16913/1133</td><td></td></tr><tr><td>LN2ハンドリング用ゴーグル&nbsp;&nbsp;</td><td>3メートル</td><td>&nbsp;40661-00000-10</td><td>曇り止め、傷防止コーティング</td></tr><tr><td>ホットプレート</td><td>ラベック</td><td>LA-SH-II-5B</td><td>デジタルモデル</td></tr><tr><td>識別ロッド&nbsp;</td><td>IMVテクノロジー</td><td>6326</td><td>非滅菌 LG48 mm</td></tr><tr><td>断熱発泡スチロール容器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LN2 ストレージデュワー</td><td>テイラー・ウォートン</td><td>XT21-AI</td><td>クライオサイエンス</td></tr><tr><td>長いステンレス鋼のピンセット</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11000-25</td><td></td></tr><tr><td>M2&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>M7167</td><td></td></tr><tr><td>PBS&nbsp;</td><td>自家製</td><td></td><td>リン酸緩衝生理食塩水。通常、1 Lの濃縮5xバッファーを調製し、1xに希釈します。レシピ:塩化ナトリウム40 g、塩化カリウム1 g、無水リン酸二ナトリウム7.2 g、リン酸一カリウム1.2 g。蒸留水を加え、オートクレーブで滅菌します。</td></tr><tr><td>プラスチックペトリ皿&nbsp;</td><td>隼</td><td>&nbsp;&nbsp;351029</td><td>TC処理されていない細菌学用ペトリ皿</td></tr><tr><td>実体顕微鏡&nbsp;</td><td>オリンポス</td><td>SZ2-LGB型</td><td></td></tr><tr><td>ショ糖&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>S1888</td><td></td></tr><tr><td>時計職人s #5鉗子&nbsp;</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11254-20</td><td></td></tr></tbody></table>

哺乳類胚のガラス化のためのスパチュラモンテビデオ

Spatula Montevideo Device for the Vitrification of Mammalian Embryos

This study describes an efficient and cost-effective vitrification method for mouse and sheep embryo cryopreservation known as the Spatula Montevideo ...

遺伝子組み換えマウスモデルを生成し、バックアップとして系統を凍結保存します。このためには、胚をガラス化するための簡単で低コスト、効率的で再現性のある方法が必要です。CRISPR-Cas9のマイクロインジェクションまたはエレクトロポレーションは、ガラス化、ウォームアップマウスおよび家畜の受精卵で行うことができ、その結果、より柔軟なスケジュールが可能になり、使用中の動物が減ります。胚のガラス化は、超急速冷却を使用して氷の結晶形成を防ぎ、細胞の完全性を維持します。この技術は凍結生物学研究を進歩させ、胚の生存率、遺伝的安定性、長期保存結果に関する研究を可能にします。スパチュラMVDと溶液はどちらも自家製です。スパチュラは0.5ミリリットルのストローで密封されており、液体窒素デュワーのスペースを最小限に抑えます。[講師]まず、最初の10ミリメートルとゲルローダーチップのチップコーンを切り取ります。時計職人のナンバーファイブ鉗子を使用して、ゲルローダーの先端を先端から約1センチメートル持ち、ブンゼンバーナーの炎に8〜10秒間そっと入れて、パドルのようなプラットフォームを形成します。次に、先端を炎から取り外し、鉗子で5秒間しっかりと保持し続けます。実体顕微鏡を使用して、約1平方ミリメートルのパドル状のプラットフォームが形成され、遠位端が密閉されていることを確認します。製造されたスパチュラを紫外線で滅菌し、滅菌チューブまたは箱に入れて保管します。ガラス化当日は、スパチュラと同じ数のロッドにラベルを貼り、油性マーカーまたは液体窒素耐性ステッカーラベルでガラス化します。へらを 1 つずつ取り出し、プラットフォームの反対側の端から取ります。各スパチュラに識別ロッドを挿入し、実体顕微鏡ベースに置きます。液体窒素を10 x 30 x 20センチメートルの断熱ポリスチレン容器に注ぎます。スパチュラごとに0.5ミリリットルのストローを1本容器に入れます。各スパチュラについて、100ミリメートルのプラスチックペトリ皿に100マイクロリットルのM2溶液、20マイクロリットルのPV溶液、および20マイクロリットルのV溶液の滴を準備します。実体顕微鏡下で、30〜40個の胚をM2ドロップに入れます。吸引管アセンブリに取り付けられた引っ張られたガラス毛細管を使用して、毛細管にM2培地と少なくとも1マイクロリットルのPV溶液を予装します。胚を吸引し、PV溶液滴中で30秒間インキュベートします。毛細管に少なくとも1マイクロリットルのV溶液をロードし、胚をV溶液ドロップに移します。室温でさらに30秒間インキュベートします。最小のV溶液(約0.1マイクロリットル)を使用して胚を吸引し、スパチュラプラットフォームにすばやく配置します。スパチュラのロッドを持ちながら、すぐにスパチュラプラットフォームを液体窒素に

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

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マウスモデルにおける子宮卵管胚移植と精管切除

神経前駆有糸分裂は、神経新生の重要なパラメータである。神経前駆糸分裂の我々の理解の多くは、固定された組織の分析に基づいている。胚性脳スライス内のライブイメージングは​​、制御された環境で、高い時間·空間分解能で有糸分裂を評価するための汎用的な手法である。...

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タイムラプス形態プロトコル previtrification...

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胚盤胞生検およびガラス化は、移植前遺伝子検査を効率的に行うために必要とされる。5-7日目のゾナ・ペルシダの順次開きと7-8型栄養細胞の検索を伴うアプローチは、必要な操作の数と、最適でない環境条件への胚の暴露の両方を制限する。...

ヒト胚盤胞生検とガラス化

ここでは、ガラス化されたヒト胚盤胞を温め、インビトロでの移植期間を通じてそれらを培養し、それらを単一細胞に消化し、さらなる調査のために早期の栄養芽細胞を採取する方法を説明する。...

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Cumulus-Oocyte Complexesの即時部分的除去:体外受精の迅速観察のための洗練されたアプローチ

学ぶスパチュラモンテビデオ法によるマウスとヒツジの着床前胚ガラス化技術。自作スパチュラと凍結保護液を用いて液体窒素に急速浸漬し、高い生存率で胚を長期保存する再現性のある手法です。

哺乳類胚のガラス化のためのスパチュラモンテビデオ

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