Name: インビボTurboIDに基づく近接ラベリングのDrosophila melanogasterへの応用 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-13T13:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: 学ぶTurboID近接ラベリングを用いたDrosophila melanogaster生殖細胞におけるタンパク質相互作用の同定法。新規相互作用タンパク質の発見と分子メカニズムの解明に貢献します。

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<ol><li>Kim, D. I., Roux, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filling+the+void%3A+Proximity-based+labeling+of+proteins+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Trend+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Filling the void: Proximity-based labeling of proteins in living cells.</a> Trend Cell Biol. 26 (11), 804-817 (2016).</li>
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<li>Artan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactome+analysis+of+Caenorhabditis+elegans+synapses+by+turboid-based+proximity+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Interactome analysis of Caenorhabditis elegans synapses by turboid-based proximity labeling.</a> J Biol Chem. 297 (3), 101094(2021).</li>
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<table><tbody><tr><td>抗体</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗マウスIgG(H+L)二次抗体、HRP</td><td>Invitrogen</td><td>31430</td>分析<td>グレード、光感受性</td></tr><tr><td>ヤギ抗ウサギIgG(H+L)高度交差吸着二次抗体、alexa fluor plus 488</td><td>Invitrogen</td><td>A32731</td><td>分析グレード、光感受性</td></tr><tr><td>ヤギ抗ウサギIgG(H+L)二次抗体、HRP</td><td>Invitrogen</td><td>31460</td><td>分析グレード、光感受性</td></tr><tr><td>HSP90 抗体 (ウサギ)</td><td>細胞シグナル伝達技術</td><td>4874</td><td>ポリクローナル抗体</td></tr><tr><td>Pierce ストレプトアビジンタンパク質、HRP</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21126</td><td>分析グレード</td></tr><tr><td>ストレプトアビジン、Alexa Fluor 594 コンジュゲート</td><td>Invitrogen</td><td>S11227</td><td>感光性、分析グレード</td></tr><tr><td>V5タグ抗体(マウス)</td><td>Invitrogen</td><td>R960-25</td>モノ<td>クローナル抗体</td></tr><tr><td>V5タグ抗体(ウサギ)(D3H8Q)</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>13202</td>モノ<td>クローナル抗体</td></tr><tr><td>Fly Lines</td><td>strongCompany</td><td>カタログ番号</td><td>コメント/説明</td></tr><tr><td>pUASp Tom20 V5-TurboID/TM3</td><td>韓国ショウジョウバエストックセンター</td><td>2373-2</td><td>フライストック</td></tr><tr><td>pUASp ズッキーニ V5-TurboID/Cyo</td><td>韓国ショウジョウバエストックセンター</td><td>2188</td><td>フライストック</td></tr><tr><td>pUASP_attB_V5-TurboID-NES/Cyo</td><td>韓国ショウジョウバエストックセンター</td><td>2635-4</td><td>フライストック</td></tr><tr><td>w[*];P{w[+mC]=matalpha4-GAL-VP16}V2H</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>7062</td><td>ハエストック</td></tr><tr><td>機器および消耗品</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント/説明</td></tr><tr><td>分析天びん</td>メ<td>トラー・トレド</td><td>ME204</td><td>0.1 mg の可読性</td></tr><tr><td>Amersham Protran 0.45 NC ニトロセルロース ウェスタンブロッティングメンブレン (300 mm & 4 m)</td><td>Cytiva</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>10600002-Axygen 1.7 mL MaxyClear Snaplock マイクロ遠心分離管</td><td>Corning</td><td>MCT-175-C</td><td>コポリマー</td></tr><tr><td>BRAND&nbsp;カバーガラス(22 mm x 22 mm)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BR470055</td><td>ホウケイ酸ガラス</td></tr><tr><td>バルクピペットチップ(10 & micro;L)</td><td>Vertex</td><td>4110N00</td>プロ<td>ピレン</td></tr><tr><td>バルクピペットチップ(1000&micro;L)</td><td>Vertex</td><td>4330N00</td>プロ<td>ピレン</td></tr><tr><td>バルクピペットチップ(200&micro;L)</td><td>Vertex</td><td>4230N00</td><td>プロピレン</td></tr><tr><td>細胞培養プレート(96ウェル)</td><td>SPL</td><td>300096</td><td>ポリスチレン平底型</td></tr>遠<tr><td>心分離機(1.5-2 mLチューブサイズローター付き)</td><td>エッペンドルフ</td><td>5424 R</td><td>固定角冷</td></tr><tr><td>蔵遠心分離機(5 mLチューブサイズローター付き)</td><td>エッペンドルフ</td><td>5425 R</td> 固定<td>角冷蔵</td></tr><tr><td>ケミカルスプーン</td><td></td><td></td><td>ステンレス製</td></tr><tr><td>ChemiDoc イメージングシステム</td><td>Biorad</td><td>12003153</td><td>ウェスタンブロットイメージングシステム</td></tr><tr><td>CO2 フライパッド</td> <td>-</td><td></td> <td>麻酔ボード</td></tr><tr><td>CO2 タンク&レギュレーター</td> <td>-</td><td></td> <td>高圧ガスとめまいの注意</td></tr> コンパクト<tr><td>インキュベーター</td><td>JSR JSGI-10T</td><td></td><td>高の注意温度</td></tr>共<tr><td>焦点レーザー走査顕微鏡</td><td>Zeiss</td><td>LSM 710</td><td>強力なレーザービームの注意</td></tr><tr><td>コニカルチューブ(15 mL)</td><td>SPL</td><td>50015</td><td>ポリプロピレン/高密度ポリエチレン&nbsp;</td></tr><tr><td>コニカルチューブ(50mL)</td><td>SPL</td><td>50050</td>ポリ<td>プロピレン/高密度ポリエチレン&nbsp;</td></tr><tr><td>デジタル天びん</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>デジタルタイマー</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr>解剖<tr><td>皿</td><td>-</td><td>-</td><td>シリコン</td></tr><tr><td>デュモン #5SF 鉗子&nbsp;</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11252-00</td>超<td>微細チップ、鋭利な物体への注意</td></tr><tr><td>DynaMag-2磁石</td><td>Invitrogen</td><td>12321D1.5-2mL</td><td>サイズのマイクロ遠心分離管用</td></tr><tr><td>Fisherbrand&nbsp;スーパーフロストプラス顕微鏡スライド(25 mm x 75 mm)</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>12-550-15</td>鋭<td>利な物体の注意</td></tr>フライフード<tr><td>ボトル(紙プラグ付き)</td><td>ハンソルテック</td><td>FFB-21010</td><td>-</td></tr><tr><td>フライフードバイアル(コットンキャップ付き)</td><td>ハンソルテック</td><td>FFV-11010</td><td>-</td></tr><tr><td>集束超音波装置</td><td>Covaris</td><td>M220</td>超音波ゲ<td></td></tr><tr><td>ルナイフ</td>の注意<td>Invitrogen</td><td>EI9010</td><td>プラスチックハンドル付きステンレス鋼</td></tr><tr><td>グレード 3MM Chr あぶらとら紙 (46 cm & 57 cm)</td><td>Cytiva</td><td>3030-917</td><td>Whatmann 紙</td></tr><tr><td>ハンドヘルドホモジナイザーとプラスチック乳棒</td><td>キンブル</td><td>749540-0000</td><td>コードレスモーター</td></tr><tr><td>ヒートブロック</td><td>ファインPCR</td><td>ALB6400</td><td>高温の注意</td></tr><tr><td>糸くずのないティッシュ</td><td>Yuhan-Kimberly</td><td>41112</td><td>-</td></tr><tr><td>液体窒素</td><td></td>-<td>-</td>凍<td>傷や火傷への注意</td></tr><tr><td>マイクロプレート分光光度計</td><td>Agilent Technologies</td><td>Epoch</td><td>モノクロメーターベースの光学系</td></tr><tr><td>マイクロ波</td><td>-</td><td>-</td><td>高温への注意</td></tr><tr><td>milliTUBE 1 mL AFA ファイバー</td><td>Covaris</td><td>PN 520135</td><td>Glass</td></tr><tr><td>ミニゲルタンク</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A25977</td><td>高温の注意</td></tr><tr><td>NuPAGE Bis-tris ミニプロテインゲル、4&ndash;12%、1.0&ndash;1.5 mm、10ウェル</td><td>Invitrogen</td><td>NP0323BOX</td><td>ポリアクリルアミドを含む、毒性注意</td></tr><tr><td>NuPAGE Bis-trisミニプロテインゲル、4&ndash;12%、1.0&ndash;1.5 mm、15ウェル</td><td>Invitrogen</td><td>NP0321BOX</td><td>ポリアクリルアミドを含み、毒性の注意</td></tr> ペイン<tr><td>トブラシ (&Oslash; 1.8 mm)</td><td>Hwa hong</td><td>791240-Pipetman</td><td></td></tr> <tr><td>L (P1000L)</td><td>Gilson</td><td>FA10006M</td><td>金属エジェクター付きシングルチャンネルマイクロピペット</td></tr><tr><td>Pipetman L (P200L)</td><td>Gilson</td><td>FA10005M</td><td>金属エジェクター付きシングルチャンネルマイクロピペット</td></tr><tr><td>Pipetman L (P20L)</td><td>Gilson</td><td>FA10003M</td><td>金属エジェクター付きシングルチャンネルマイクロピペット</td></tr><tr><td>Pipetman L (P2L)</td><td>Gilson</td><td>FA10001M</td><td>金属エジェクター付きシングルチャンネルマイクロピペット</td></tr><tr><td>電源</td><td>メジャーサイエン</td>ス <td>MP-310</td><td>高電圧電気の注意</td></tr><tr><td>プログラマブルローテーター</td><td>Biosan</td><td>RS-24-Protein</td><td></td></tr> <tr><td>LoBind&nbsp;チューブ</td><td>エッペンドルフ</td><td>30108302</td><td>-</td></tr><tr><td>カミソリの刃</td><td>Dorco</td><td>304020</td><td>ステンレス鋼、鋭利な物体への注意</td></tr><tr><td>ローラー</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>血清ピペット (10 mL)</td><td>SPL</td><td>91010</td><td>ポリスチレン</td></tr><tr><td>血清ピペット (25 mL)</td><td>SPL</td><td>91025</td><td>ポリスチレン</td></tr><tr><td>血清ピペット (5 mL)</td><td>SPL</td><td>91005</td><td>ポリスチレン</td></tr><tr><td>血清ピペット (50 mL)</td><td>SPL</td><td>91050</td><td>ポリスチレン</td></tr><tr><td>スナップ キャップ低保持マイクロ遠心チューブ (1.5 mL)</td><td>Thermo Scientific</td><td>3451PK</td><td>ポリプロピレン</td></tr><tr><td>スポンジ パッド</td><td>Invitrogen</td><td>EI9052</td><td>-</td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 508</td><td>-</td></tr><tr><td>実体顕微鏡&nbsp;</td><td>ライカ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>サーモミキサー&nbsp;C</td><td>Eppendorf</td><td>5382000015</td><td>1.5 mL および 5 mL サイズのブロック付き</td></tr><tr><td>ピンセット</td><td>Aven Tools</td><td>18526</td><td>プラスチック、フラットチップ</td></tr><tr><td>ボルテックスミキサー</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-0236-XCell</td><td></td></tr> <tr><td>II ブロットモジュール</td><td>Invitrogen</td><td>EI9051</td><td>高温への注意</td></tr><tr><td>XCell&nbsp;SureLock ミニセル</td><td>Invitrogen</td><td>EI0001</td><td>高温注意</td></tr><tr><td>化学薬品</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント/説明</td></tr>ア<tr><td>セトン</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>650501</td><td>分析グレード</td></tr><tr><td>アセトニトリル</td><td>Supelco</td><td>1.00029.1000</td><td>LC-MSグレード、吸入毒性および可燃性</td></tr>アル<tr><td>ブミン標準アンプル(0.9%生理食塩水および0.05%アジ化ナトリウムに2 mg/mLのウシ血清アルブミン(BSA)を含む)</td><td>Thermo Scientific</td><td>23209</td><td>Pierce BCAプロテインアッセイキットの一部(Thermo Scientific、23225)</td></tr>アル<tr><td>ブミン、ウシ血清</td><td>Bioshop</td><td>ALB001</td>分析<td>グレード</td></tr>重<tr><td>炭酸アンモニウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>09830</td><td>分析グレードの</td></tr><tr><td>ビオチン&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4639</td><td>細胞および組織培養グレード</td></tr><tr><td>塩化カルシウム (CaCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td>細胞培養グレード</td></tr><tr><td>Clarity ウェスタン ECL 基質</td><td>Biorad</td><td>1705060</td><td>分析グレード</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MBD0015</td><td>感光性、分析グレード</td></tr>の<tr><td>ジチオスレイトール (DTT)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>R0861</td><td>分析グレード</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>コーニング</td><td>35-015-CV</td><td>細胞培養グレード</td></tr><tr><td>ギ酸</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>F0507</td><td>試薬グレード、吸入毒性の注意</td></tr><tr><td>グレース昆虫培地</td><td>ギブコ</td><td>11595030</td><td>細胞培養グレード</td></tr><tr><td>インスタントドライイースト</td><td>ブランドなし</td><td>N1019</td><td>-</td></tr><tr><td>ヨードアセトアミド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1149</td><td>感光性分析グレード</td></tr>メタ<tr><td>ノール</td><td>Carlo Erba</td><td>41484</td><td>分析グレード</td></tr><tr>マ<td>ニキュア</td> <td>-</td><td></td> <td>クリアタイプ</td></tr><tr><td>Novex Tris-glycine SDS サンプルバッファー (2X)</td><td>Invitrogen</td><td>LC2676</td><td>分析グレード</td></tr><tr><td>NuPAGE MOPS SDS ランニングバッファー (20X)</td><td>Invitrogen</td><td>NP0001</td><td>分析グレード</td></tr><tr><td>PageRuler 染色済みタンパク質ラダー</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26616</td><td>分析グレード</td></tr><tr><td>フェニルメタンスルホニルフッ化物&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>36978</td><td>分析グレード</td></tr><tr><td>リン酸塩緩衝液生理食塩水</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td>分析グレード</td></tr><tr><td>Pierce 16% ホルムアルデヒド (w/v)Thermo</td> <td>Fisher Scientific</td><td>28908</td><td>分析グレード、感光性</td></tr><tr><td>Pierce BCA タンパク質アッセイキット</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td>分析グレード</td></tr><tr><td>Pierce BCA試薬A(炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、ビシンコニン酸、酒石酸ナトリウムを0.1 M水酸化ナトリウムに含む)</td><td>Thermo Scientific</td><td>23228</td><td>Pierce BCAプロテインアッセイキットの一部(Thermo Scientific、23225)</td></tr><tr><td>Pierce BCA試薬B(4%硫酸第二銅を含む)</td><td>Thermo Scientific</td><td>1859078</td><td>Pierce BCAプロテインアッセイキットの一部(Thermo Scientific、23225)</td></tr><tr><td>プロピオン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>402907</td><td>ACS グレード</td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤 カクテル セット III</td><td>カルビオケム</td><td>539134</td><td>細胞および組織培養グレード</td></tr><tr><td>スローフェード ゴールド 退色防止マウント剤</td><td>Invitrogen</td><td>S36936</td><td>感光性</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム (NaCl)</td><td>Bioneer</td><td>C-9025</td><td>分析グレード</td></tr><tr><td>デオキシコール酸ナトリウム</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>D6750</td><td>分析グレード</td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71736</td><td>分子グレード</td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム (NaOH)</td><td>Biosesang</td><td>SR2018-100-00</td><td>分析グレード</td></tr><tr><td>トリプル蒸留水</td> <td>-</td><td></td> <td>超高純度 (タイプ 1)</td></tr> <tr><td>トリス緩衝生理食塩水</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>94158</td><td>分析グレード</td></tr><tr><td>トリスグリシン移送緩衝液</td><td>Koma Biotech</td><td>K0341001</td><td>分析グレード</td></tr><tr><td>Tris-HCl、pH 8</td><td>Bioneer</td><td>C-9006</td><td>分析グレード</td></tr><tr><td>Triton x-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93443</td><td>分子グレード</td></tr><tr><td>トリプシン</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20233</td><td>細胞培養グレード</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416</td><td>分子グレード</td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U5378</td><td>分子&細胞培養グレード</td></tr></tbody></table>

インビボturboidに基づく近接ラベリングのdrosophila melanogasterへの応用

In Vivo Application of TurboID-based Proximity Labeling in Drosophila melanogaster

出力例は、 図1、 図2、 図3、 図4 に示されており、以前にNguyenらによって公開されました20。 図1 は、 ショウジョウバエ 卵巣におけるTurboIDベースのPLの実験手順を示しています。まず、ZucとTurboIDを組み合わせたコンストラクト(Zuc-V5-TurboID)を生成しました。よく知られた明確なサブオルガネラ居住者、すなわち核輸出シグナル(NES)とトランスロカーゼ外ミトコンドリア膜(Tom20)もTurboID(NES-V5-TurboIDおよびTom20-V5-TurboID)と融合しました。NES-V5-TurboIDは、細胞質タンパク質のビオチン化に使用され、ネガティブコントロ...

インビボTurboIDに基づく近接ラベリングのDrosophila melanogasterへの応用

Proximity labeling (PL) is a powerful method for mapping protein-protein interaction networks. Advances in labeling enzymes, especially TurboID, have ...

in-vivo-application-turboid-based-proximity-labeling-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

このプロトコルは、マイクロインジェクションとで高解像度の画像の使用について説明...

に有糸分裂研究のためのマイクロインジェクション技術キイロショウジョウバエ合胞体胚

メゾスコピック蛍光トモグラフィは、組織切片の蛍光顕微鏡の浸透の制限を越えて動作します。技術は、マルチプロジェクション照明と光子輸送記述に基づいています。我々は、生体内でのGFP発現翼成虫ディスクの形態形成の全身3次元可視化を実証...

のためのメゾスコピック蛍光トモグラフィー生体内</em開発の>イメージングショウジョウバエ</em

ショウジョウバエの血球は胚の全体にわたって分散させる。このプロトコルは、蛍光標識した血球で胚を使用してこれらの移行をマウントし、イメージする方法を示します。...

のライブイメージングキイロショウジョウバエ胚性血球移行

このプロトコルは、無傷の麻酔とイメージングのための信頼性の高い方法を説明します...

サブセルラー解像度で手つかずのショウジョウバエの幼虫の in vivoイメージングで

我々は、中枢神経系における単一ニューロンを標識するための技術（CNS）の提示...

の中枢神経系における単一細胞のラベリング<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

本論文では、直接蛹殻を介して画像細胞挙動への高速走査型共焦点顕微鏡を使用する方法を示します。そのまま蛹ケースを残すことによって、このメソッドを直接学ぶことは困難であるショウジョウバエの発生段階で動的な細胞プロセスの観察と測定を可能にします。...

の蛹ケースを画像化<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

このプロトコルは、生きたショウジョウバエの蛹の眼神経上皮をイメージングするための効率的な方法を提供します。この方法は、組織の動きと不均一なトポロジーを補正し、複数のGFPタグ付き接合タンパク質を使用して細胞境界の視覚化を強化し、簡単に組み立てられるイメージングリグを使用します。...

のライブイメージングショウジョウバエ蛹アイ

記載されている RNAその場で交配のプロトコルでは、全体のショウジョウバエの胚または切り裂かれたティッシュで RNA の検出をことができます。96 ウェル マイクロ...

ショウジョウバエの胚とパスチラミドシグナル信号増幅を利用した生体表面の高解像度蛍光In Situハイブリダイゼーション

ここで我々 は説明の幼虫が 3...

生体内で1 分子追跡ショウジョウバエ運動神経がシナプス前ターミナルで

ここでは、分子ビーコン、スピニングディスク共焦点顕微鏡、オープンソース分析を用いたライブショウジョウバエメラノガスター卵室における内因性mRNA人身売買の可視化、検出、分析、追跡のためのプロトコルを提示する。ソフトウェア。...

ライブショウジョウバエメラノガスター卵室における内因性mRNAの可視化と追跡

初期のショウジョウバエの胚では、多くの細胞小器官は運動性である。原則として、それらは特定の蛍光プローブを介して生きたまま画像化することができるが、卵殻は胚への直接適用を妨げる。このプロトコルは、マイクロインジェクションを介してそのようなプローブを導入し、次いで粒子画像速度測定を介してバルクオルガネラ運動を分析する方法を記述している。...

ショウジョウバエ胚における脂質含有細胞小器官の細胞骨格依存性トラフィッキングの可視化

学ぶTurboID近接ラベリングを用いたDrosophila melanogaster生殖細胞におけるタンパク質相互作用の同定法。新規相互作用タンパク質の発見と分子メカニズムの解明に貢献します。

インビボTurboIDに基づく近接ラベリングのDrosophila melanogasterへの応用

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