インビボTurboIDに基づく近接ラベリングのDrosophila melanogasterへの応用

この研究では、TurboIDベースの近接標識を使用して、ショウジョウバエ卵巣の生殖細胞におけるズッキーニタンパク質の相互作用をマッピングします。ズッキーニのよく知られた相互作用者と新しい相互作用者の両方が特定されました。特に、いくつかの新しい相互作用体がタンパク質の折り畳み、膜組織化、および物理的輸送に関与していることが判明しました。この研究では、TurboIDは、バックグラウンドのビオチン化を制御しながら、動物組織の効果的な標識に使用されます。標識特異性とタンパク質のカバレッジは、コントロールを最適化し、トリプシン処理後にビオチン化ペプチドを濃縮することで強化されます。このアプローチにより、タンパク質相互作用の全身スクリーニングが可能になり、目的のタンパク質の機能と分子メカニズムが明らかになります。

[ナレーター]まず、酵母粉末を三重蒸留水に溶かして調製したスプーン一杯の滑らかな酵母ペーストをバイアルの壁に塗布します。孵化したばかりのハエが入った別のバイアルを手に取り、軽くたたいて底にあるハエを集めます。このバイアルをイーストペーストの入ったバイアルに逆さまにし、ハエが逃げないように縁を合わせます。両方のバイアルを一緒にタップして、ペーストの入ったバイアルの底の部分にハエを移します。移送が完了したら、綿のキャップを両方のバイアルにしっかりと置き、3日間待ちます。3日目に、1モルのビオチンストックを3重蒸留水で希釈して、100マイクロモルのビオチン作業溶液を調製します。500マイクロリットルの0.5%プロポン酸を溶液に加えます。ビオチン溶液をドライイーストパウダーと混ぜてペースト状にします。実験室のスプーン一杯のビオチン酵母ペーストをビオチン食品バイアルの壁に加えます。ハエを2つのグループに分けます。1つのグループをコントロールとして通常の食品の入ったバイアルに移します。他のグループをビオチン酵母ペーストを添加したビオチン食品バイアルに移して、ビオチンの高揚感を開始します。16時間後、ハエを通常の餌の入った新しいバイアルに移します。ショウジョウバエの卵巣収集には、1ミリリットルの冷たいグレース昆虫培地を解剖皿にピペットで入れます。細い先端鉗子を使用して、メスのハエを解剖皿に入れ、培地に浸します。体を押しつぶさずに1対の鉗子で胸部を保持します。別の鉗子を使用して、性器が位置する後腹部の先端をそっと取り除きます。鉗子を使用して、上腹部から下に向かってゆっくりと卵巣を絞り出します。卵巣を損傷することなく、筋肉のネットと周囲の組織を取り除きます。鉗子を使用してきれいな卵巣を1.7ミリリットルのチューブに移し、チューブを氷の上に置きます。組織溶解のために、プロテアーゼ阻害剤カクテルを添加した緩衝生理食塩水中の500マイクロリットルの2%ドデシル硫酸ナトリウムを卵巣を含むチューブに加えます。細胞が溶解し、溶液が粘着性になるまで待ちます。画面に表示されている条件を使用して超音波処理を実行します。次に、アセトン沈殿のために、ライセートを5ミリリットルの低結合チューブに移します。サンプル量の6倍の冷たいアセトンをチューブに加えます。チューブを短時間ボルテックスしてから、マルチローテーターにロードし、摂氏マイナス20度で約16時間一晩インキュベートします。沈殿したタンパク質を摂氏4度で15分間15,000 Gで遠心分離することによりペレット化します。次に、90%の冷アセトンと10%の緩衝生理食塩水からなる混合溶液を2ミリリットル加えます。ペレットと溶液を上下にピペッティングして混合します。チューブを短時間ボルテックスしてから、再度マルチローテーターにロードし、摂氏マイナス20度で2時間インキュベートします。沈殿したタンパク質を摂氏4度で15分間15,000 Gで遠心分離することによりペレット化します。上清を捨てた後、摂氏4度でスピンします。次に、チューブを開き、ペレットを10分間自然乾燥させます。タンパク質ペレットを500マイクロリットルの8モル尿素に再懸濁します。溶液を、適応集束音響またはAFAファイバーを含む1ミリリットルサイズのミリチューブに移します。ビシンコニン酸(BCASA)を実行する前に、先に示したのと同じパラメーターを使用してチューブを超音波処理し、タンパク質濃度を決定します。摂氏37度で1時間、450 RPMに設定したサーモブロックを使用してタンパク質を変性させます。3 重蒸留水に溶解した 1 モルのジチオスレイトールを 5 マイクロリットルをチューブに加え、最終濃度 10 ミリモルにします。チューブを摂氏37度で1時間サーモブロックに再度置き、タンパク質を減らします。次に、55マイクロリットルの400ミリモルヨードアセトアミド溶液をサンプルチューブに加え、最終濃度40ミリモルに達してから、チューブをサーモブロックに戻してアルキル化します。 総量が4ミリリットルに達するまで、50ミリモルの重炭酸アンモニウム溶液を加えてサンプルを希釈します。4マイクロリットルの1モル塩化カルシウム原液をチューブに加え、最終濃度1ミリモルに達します。溶液を均質化するために上下にピペットで移動します。次に、1ミリリットルあたり1ミリグラムのトリプシン原液150マイクロリットルをチューブに加え、トリプシンとサンプルの比率を1対20に維持します。摂氏37度で16時間、450 RPMに設定されたサーモブロックを使用してタンパク質を消化します。サンプル3ミリグラムあたり150マイクロリットルのストレプトアビジン共役磁気ビーズを、1ミリリットルの2モル尿素で緩衝生理食塩水で洗浄します。消化したペプチドを1ミリリットルのビーズ入ったチューブにピペットで入れ、穏やかに混合します。混合物を残りのペプチドサンプルと5ミリリットルの低結合チューブで混合します。1時間インキュベートした後、1ミリリットルの混合物を1.5ミリリットルのチューブに移し、磁気ラックに1分間置きます。50ミリモルの重炭酸アンモニウムで1ミリリットルの2モル尿素でビーズを2回洗浄し、1ミリリットルの三重蒸留水で1回洗浄してから、チューブを磁気ラックにさらに1分間戻し、バッファーを廃棄します。次に、100マイクロリットルのエルシアンバッファーをビーズ含有チューブにピペットで入れ、穏やかに混合し、摂氏60度で5分間300 RPMに設定されたサーモブロックを使用してペプチドを溶出してから、チューブを再び磁気ラックに置きます。次に、溶出液をビーズを避けて、新しい1.5ミリリットルチューブに移します。溶出したサンプルは乾燥させ、質量分析に使用する準備が整いました。この図は、ズッキーニV5 TurboIDの共焦点イメージングとプロテオミクス相互作用分析を示し、近位タンパク質と相互作用タンパク質を同定します。共焦点画像は、V5抗体とストレプトアビジン結合Alexa Fluer 594によってそれぞれ捕捉されたように、ビオチン摂食処理後の導入遺伝子と近位タンパク質の間の強い重複発現を明らかにしました。ズッキーニV5 TurboIDプロテオームの遺伝子オントロジー解析により、シャペロンを介したタンパク質の折り畳み、内膜系の組織化、および小胞体からGGI装置への輸送の調節に関与するビオチン化タンパク質が濃縮されていることが明らかになりました。