Name: ネットワーク薬理学と慢性拘束ストレス誘発性うつ病ラットモデルにおけるQiangzhifangの抗うつ薬序の検証 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-06T15:25:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: 学ぶネットワーク薬理学と分子ドッキングを用いて、慢性拘束ストレス誘発性うつ病ラットモデルにおけるQiangzhifangの抗うつ効果とHIF-1・JAK-STAT経路への調節作用を探索する。

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すべての実験プロトコルは、山東中医薬大学の動物実験倫理委員会(承認番号:YYLW2023000327)によって承認され、国立衛生研究所が発行した実験動物のケアと使用に関するガイドに準拠していました。この実験では、平均体重が(140 ± 10)gのSPFグレードの健康な雄Wistarラット40匹を使用しました(図1)。このプロトコルで使用されるすべての材料、機器、およびソフトウェアのリストについては、 資料の表 を参照してください。
1.ラットうつ病モデル
<ol>
	<li>動物の飼育とグループ化<ol>
		<li>動物と一緒に飼育室に入り、テールマーキング器具を使って番号を付けます。</li>
		<li>ラットをケージに個別に収容し、21±2°Cの温度と12時間/12時間の明暗サイクルを維持します。</li>
		<li>ラットを実験室で7日間順応させ、餌と水 を自由に利用できるように しながら、適応のために毎日ネズミを扱います。</li>
		<li>順応期間終了後、体重を測定し、ショ糖選好試験(SPT)とオープンフィールド試験(OFT)を実施します。</li>
		<li>実験データに基づいて、ラットを4つのグループに分け、各グループが10匹のラットで構成されるようにします:コントロール(CON)グループ、モデル(CRS)グループ、QZFグループ、およびフルオキセチン(F)グループ)。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>慢性拘束ストレス(CRS)ラットモデルの確立<ol>
		<li>ラット拘束装置を構築します。ラットのサイズ21に適した直径と長さの透明なプラスチックチューブを選択し、ラットが逃げないようにしながら立って内側に向きを変えることができます。電気はんだごて穴あけ器を使用して、プラスチックチューブの側面と蓋に穴を開け、適切な空気循環を確保します。</li>
		<li>薬物の毎日の胃内投与の1時間後にラットを拘束装置(グループCのものを除く)にそっと置き、ラットが快適な位置にあることを確認します。.</li>
		<li>拘束期間中は、すべての群れのネズミから餌と水を奪う。拘束期間終了後は、十分な餌と水を均一に与えてください。毎日の拘束時間を6時間(9時30分から15時30分まで)に固定し、連続して28日間維持します。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2.薬物介入
<ol>
	<li>強制経口投与:1mLの溶液/体重100g、フルオキセチン(2.7mg・kg-1・day-1)およびQZF(2g・kg-1・day-1)22。グループ C と CRS に、単一変数制御用の同等の生理食塩水を提供します。 注:毎日の薬物投与は08:00に実施され、モデル確立と同期して開始され、28日間のモデリング期間を通じて持続しました。</li>
</ol>
3.ショ糖選好試験(SPT)
<ol>
	<li>実験が始まる24時間前に、ラットから餌と水を奪います。</li>
	<li>1%ショ糖水溶液を調製し、その溶液と純水を実験動物の飲用ボトルに充填して秤量します。純水とショ糖水の消費量を、実験前後のボトルの重量を量ることにより測定します。</li>
	<li>各ラットケージカバーの取水口にショ糖溶液1本と純水1本を左と右に置きます。ラットが水分摂取のために片側を好むのを防ぐために、実験の30分後に左右の水筒の位置を入れ替えます。</li>
	<li>実験の1時間後、すべての水筒を取り外し、すぐに計量し、ショ糖溶液と純水の消費量を記録します。次の式を使用して、毎週のショ糖選好比を計算します。 ショ糖の好みの値 = <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/68198/68198eq001.jpg" style="margin: auto;"> × 100%</li>
</ol>
4. 体重測定
<ol>
	<li>ラットが実験室に入ると、毎週ラットの体重を量り、体重を量る決まった時間を午前7:00に設定します。このスケジュールは、体重の変化を観察しやすくするために確立します。</li>
</ol>
5. オープンフィールド試験(OFT)
<ol>
	<li>実験を開始する前に、ラットを行動室に1時間順応させ、オープンフィールドボックスの照明を調整して、均等に分布するようにします。追跡ソフトウェアでネズミがはっきりと見えることを確認します。</li>
	<li>ビデオ追跡および分析システムを利用して、オープンフィールドボックス(50 cm x 50 cm x 50 cm)の底面を9つの等面積の正方形グリッドに分割します。壁に隣接する 8 つの通芯を周辺領域として指定し、中央通芯を中央領域として指定します。</li>
	<li>ラットをオープンフィールドボックスの中央領域に置きます。ビデオトラッキングシステムを使用して、ラットの動きを5分間記録します。</li>
	<li>各ラットをテストした後、75%エタノールでチャンバーを洗浄して残留臭気を除去し、次のラットの行動に干渉しないようにします。オープンフィールドアクティビティの合計距離 (mm) と、OFT レコードの中央グリッドのエントリ数を入力します。</li>
</ol>
6.強制水泳テスト(FST)
注:ラット強制水泳実験は、事前実験と形式実験で構成されています。正式な実験の24時間前に、同じ手順に従って、ラットが15分間泳いで事前実験を行います。
<ol>
	<li>実験動物を実験の少なくとも30分前に行動室に運び、環境に順応できるようにします。</li>
	<li>透明な円筒形のプレキシガラス製ウォーターシリンダー(高さ50cm、直径20cm)を用意し、23〜25°Cの水で満たします。 動物の体重に基づいて水深を調整し、動物の尾がシリンダーの底から一定の距離を保つようにします。</li>
	<li>ラットをゆっくりと水筒に入れ、実験中は静かにしてください。カメラと信号収集システムをアクティブにします。300秒以内に浮遊不動の持続時間を観察し、記録します。実験の最後には、すぐにラットを水から取り出し、乾燥させます。</li>
	<li>各セッションの後、次のラットへの影響を防ぐために水を交換してください。</li>
</ol>
7. ネットワーク薬理学的予測
<ol>
	<li>QZF化合物と推定ターゲットのコレクション<ol>
		<li>Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology(TCMSP)データベース(https://old.tcmsp-e.com/)23、HERBデータベース24、およびTCMIDデータベース(https://www.bidd.group/TCMID/)にアクセスします。QZFのGZ、YZ、YZR、BS、CBM、RS、HJT、ZGCの8つのTCM名をキーワードとして、ハーブの活性化合物やターゲットを検索します。TCMSP と Swiss のターゲット予測 (http://www.swisstargetprediction.ch/) からターゲットを収集します。フィルター値を Probability* &gt; 0 に設定します。 注:通常、成分は、薬物動態学的特性に基づいて有効成分として含まれていました:経口バイオアベイラビリティ(OB)≥30%および薬物様特性(DL)≥0.1825。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>疾患ターゲットの予測<ol>
		<li>GeneCardsデータベース(https://www.genecards.org/)でキーワード「うつ病」を検索し、うつ病に関連する遺伝子標的を取得し、疾患標的の電子スプレッドシートをダウンロードし、平均値よりも高い遺伝子スコアをフィルタリングし、うつ病ターゲット26のリストをコンパイルする。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>薬物-成分-疾患-標的ネットワーク<ol>
		<li>新しいスプレッドシートを作成し、うつ病関連のターゲットと薬物ターゲットを同じ列に入力します。メニューバーの [スタート ]をクリックします |条件付き書式 |セルの強調表示ルール |重複する値。表示されるダイアログボックスで形式(たとえば、「ライトレッドフィル」)を選択します27、 クリック OK 結果を表示します。</li>
		<li>ネットワーク分析ソフトウェアを起動し、メニューバーの[ファイル]をクリックしてスプレッドシートファイルをインポートします|インポート |ネットワーク。左側のコントロールパネルにあるスタイルパネルでノードのサイズと色を調整することにより、ネットワークの外観を最適化します。ネットワークトポロジ解析を実行するには、メニューバーの[ツール]をクリックします。 |ネットワークの解析27.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>タンパク質間相互作用(PPI)ネットワーク<ol>
		<li>Jvenn(https://jvenn.toulouse.inrae.fr/app/example.html)ツールにアクセスし、化合物ターゲットと疾患ターゲットを別々にアップロードし、化合物推定ターゲットと疾患ターゲット間の重複遺伝子(OGE)をプロットします。画像内の数値をクリックしてスプレッドシートにコピーし、ベン図の画像をダウンロードします。</li>
		<li>STRING データベース (https://stringdb.org/)28 にアクセスし、スプレッドシートの OGE をデータベースに入力します。具体的には、QZF 抗うつ病のオーバーラップ ターゲット リストを [名前のリスト] ダイアログ ボックスに貼り付けます。「生物」セクションで「ホモ・サピエンス」を選択し、「検索」をクリックします。続ける。タイトルバーから[エクスポート]オプションを選択し、PNG形式とTSV形式の両方でPPIネットワークの概要テーブルをダウンロードします29。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>コアタンパク質のスクリーニング<ol>
		<li>ネットワーク解析ソフトウェア(https://cytoscape.org/)を起動します。次に、メニューバーで、[ファイル] |インポート |ネットワーク |[ファイル ]は、前の手順30で生成したTSV形式のファイルをインポートする。</li>
		<li>メニューバーで 「ネットワークの解析 」を選択し、「 解析 」ボタンをクリックします。次に、解析結果を表示し、ノード数、エッジ数、平均次数など、ネットワークの全体的な構造特性を理解します。</li>
		<li>[アプリ] |メニューバーのアプリマネージャー。MCODE を検索し、プラグインをインストールし、プラグインを実行してハブ ターゲットを取得します。次に、CytoNCAを検索し、プラグインをインストールして、Degree、Closeness centrality (CC)、Betweenness centriity (BC)の3つのパラメータ値に注目します。これらのパラメータの値に従って、一般的にコアタンパク質31と考えられているDegree、CC、およびBCが高いノードをスクリーニングする。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Gene ontology(GO)および京都遺伝子・ゲノム大百科事典(KEGG)のエンリッチメント解析<ol>
		<li>バイオインフォマティクスプラットフォーム(https://www.omicshare.com/)を開きます。[ツール ]メニューをクリックし、ID 遺伝子変換ツールを見つけてクリックします。次に、 アップロードファイル ボタンをクリックし、ターゲット遺伝子のコアで生成されたステップを選択し、変換されたファイルIDリストをダウンロードします。</li>
		<li>[ツール] メニューで、[Dynamic KEGG enrichment Analysis] ツールをクリックします。遺伝子IDリストをアップロードします。「Species」オプションで、「Homo sapiens」を選択し、「Submit」ボタンをクリックします。</li>
		<li>[ツール] メニューで、[動的 GO エンリッチメント分析] ツール |遺伝子オプション |ファイルのアップロードオプション。遺伝子IDリストを選択し、SpeciesオプションでHomo sapiensを選択します。解析用の GO タイプ(生物学的プロセス、分子機能、細胞成分など)を選択します。</li>
		<li>KEGGおよびGOエンリッチメント解析の結果について、 フィルタリングしきい値 を p &lt; 0.05に設定します。カウントを降順に並べます。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. 分子ドッキング検証
<ol>
	<li>PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/) の Web サイトにアクセスしてください。検索バーにターゲット化合物を入力します。2Dストラクチャーをクリックしてダウンロードします。</li>
	<li>PDB (https://www.Rcsb.org/) データベースを開きます。高分解能で、元の配位子を含む結晶構造を選択します。PDB ファイルをダウンロードします。</li>
	<li>タンパク質構造を最適化するには、分子可視化ソフトウェアを開きます。ダウンロードしたPDBファイルを読み込みます。水分子を除去し、最適化されたPDBファイルを保存します。</li>
	<li>分子ドッキングソフトウェアを開き、最適化されたPDBファイルをインポートします。 AutoDockToolsで、[ 編集]をクリックします|水 分子を削除するには、水を削除します。 [編集] |水素の添加 | タンパク質とリガンドに水素原子を追加するために加える29。</li>
	<li>AutoDockTools で、レセプタ バーを receptor.pdbqt に、リガンド バーを ligand.pdbqt に設定します。pdbqt を開きます。ファイルしてタンパク質とリガンドの結合部位を表示し、ドッキングボックスのサイズと位置を設定して、受容体タンパク質とリガンド化合物を完全に囲むことができるようにします。AutoDockToolsで、[グリッド]をクリックします|[グリッド ボックスを定義]では、ボックスの中心座標と寸法を設定し、分子ドッキングにデフォルト値を使用します。ドッキングフレームは、結合エネルギーの降順で自動的にソートされます。</li>
	<li>結果ファイルを開き、最適な結合エネルギー値を記録します。結合エネルギーが低いほど、結合が安定していることを示します。分子可視化ソフトウェアを使用して、結果ファイルを読み込みます。リガンドと受容体の相互作用がはっきりと表示されるように、表示と色を調整します。</li>
</ol>
9. 統計分析
<ol>
	<li>科学データ分析および視覚化ソフトウェアで統計分析を実施し、すべてのデータをSEM±平均として表します。2つ以上のグループ間の比較に一元配置分散分析を使用します。</li>
	<li>0.05 &lt; P の値を統計的に有意であるとします。</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>動物行動分析システム</td><td>Shanghai Xinsoft Information Technology Co., LTD</td><td>XR-スーパーメイズ</td><td></td></tr><tr><td>オートドックツール</td><td>スクリップス研究所</td><td></td><td></td></tr><tr><td>サイトスケープ&nbsp;ソフトウェア</td><td>サイトスケープコンソーシアム</td><td>バージョン 3.7.2</td><td></td></tr><tr><td>電動はんだごて穴あけパンチャー</td><td>南京ナイウェイテクノロジー株式会社</td><td></td><td></td></tr><tr><td>フルオキセチン</td><td>リリー蘇州製薬有限公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>露天実験システム</td><td>Shanghai Xinsoft Information Technology Co., LTD</td><td>XR-XZ301</td><td></td></tr><tr><td>パイモール</td><td>シュル&ouml;ディンガー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qiangzhifang&nbsp;</td><td>山東中医薬大学付属病院、済南、中国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>透明プラスチックチューブ&nbsp;</td><td>南通白陽プラスチック製品有限公司&nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ネットワーク薬理学と慢性拘束ストレス誘発性うつ病ラットモデルにおけるqiangzhifangの抗うつ薬序の検証

Network Pharmacology and Validation of the Antidepressant Mechanisms of Qiangzhifang in a Chronic Restraint Stress-induced Depression Rat Model

CRS誘発ラットうつ病モデルにおける行動試験結果 
ショ糖選好試験結果 ベースラインでは、群間でショ糖選好係数に差はありませんでした(P &gt; 0.05)。28日間の介入後、CRS群のショ糖選好係数はCON群よりも有意に低かった(P &lt; 0.05)一方で、F群とQZF群はCRS群と比較して有意に高い係数を示した(ともに P &lt; 0.01)。その結果、ストレスを受けたラットは典型的な無快感症状を示し、FおよびQZFによる治療によって緩和されたことが示されました(図2A)。
体重の結果 CRS導入前は、群間で有意差は認められませんでした(P &gt; 0.05)。4週間のストレス後、CRS群の体重増加率はCON群よりも有意に低かった(P &lt; 0.01...

ネットワーク薬理学と慢性拘束ストレス誘発性うつ病ラットモデルにおけるQiangzhifangの抗うつ薬序の検証

Depression is a complex psychiatric disorder that poses significant treatment challenges.Qiangzhifang (QZF), a compound used in traditional Chinese ...

この研究は、Qiangzhifang がうつ病に対してどのように作用するかを調査し、主要な有効成分を特定し、その作用機序を理解することを目的としています。この研究は、うつ病を追跡するための Qiangzhifang の特定のメカニズムと有効成分を理解する際のギャップを埋めます。Qiangzhifang が免疫系にどのような影響を与えるかを研究して、うつ病を見つけ、その潜在的な新しい治療用途を探ります。[ナレーター]まず、ラットの大きさに適した直径と長さの透明なプラスチックチューブを選択してネズミ拘束装置を構築し、ラットが逃げを防ぎながら中に立ったり回転したりできるようにします。電動はんだごて穴あけ機を使用して、プラスチックチューブの側面と蓋に穴を開け、空気の循環を適切に確保します。ラットを4つのグループに分け、各グループが10匹のラットで構成されるようにします。薬物の毎日の胃内投与の1時間後、対照群を除くラットを拘束装置にそっと置き、快適な位置にあることを確認します。フルオキセチングループには1日あたり2.7ミリグラムのフルオキセチンを投与し、両方の溶液で体重100グラムあたり1ミリリットルの投与量を使用して、強制経口を介して強志方グループに1日あたり2グラム/キログラムのフルオキセチンを投与します。.実験動物の飲料ボトルに純水または1%スクロース水溶液を入れます。各溶液を別々のボトルに入れ、ボトルの重量を量ります。各ネズミケージの取水口にスクロース溶液のボトル1本と純水のボトル1本を置きます。左に1つ、右に1つ、無料で飲みに行ける。30分後、サイドの好みを避けるためにボトルの位置を切り替えます。1時間後、すべての水筒を取り外します。すぐに重量を量り、両方の溶液の消費値を測定します。次に、与えられた式を使用して毎週のスクロース選好率を計算します。毎週朝7時の決まった時間にラットの体重を量ります。体重の変化を監視します。オープンフィールドボックスの照明を調整して、追跡ソフトウェアでネズミを均一に分布させ、明確に視認できるようにします。ビデオ追跡および分析システムを使用して、オープンフィールドボックスの底面を9つの等しい正方形のグリッドに分割し、壁に隣接する8つのグリッドを周辺領域として、中央を中央領域として分割します。ラットをオープンフィールドボックスの中央エリアに置き、追跡システムを使用してその動きを5分間記録します。各ラットをテストした後、オープンフィールドチャンバーを75%エタノールで洗浄して、残留臭気を取り除き、次のラットの行動への干渉を防ぎます。オープンフィールドアクティビティの合計距離と、オープンフィールドテストレコードの中央グリッドのエントリ数を入力します。透明なプレキシガラスのウォーターシリンダーを取り、摂氏23〜25度の温度の水を入れます。動物の体重に応じて水深を調整し、ネズミの尻尾が底から一定の距離を保つようにします。カメラと信号取得システムを作動させた後、実験中ずっと沈黙を保ちながら、ゆっくりとネズミを水筒に入れます。300秒以内の浮遊不動の持続時間を観察し、記録します。セッションの最後に、すぐにネズミを水から取り出し、乾かします。各セッションの後、次のネズミに影響を与えないようにシリンダー内の水を交換します。Access、伝統的な漢方薬システム薬理学またはTCMSPデータベース、ハーブデータベースおよびTCMIDデータベース。Qiangzhifangの8つの伝統的な漢方薬の名前をキーワードとして使用して、ハーブの活性化合物とターゲットを検索します。TCMSPとスイスのターゲット予測データベースからターゲット情報を収集します。フィルター値をゼロより大きい確率に設定します。次に、GeneCardsデータベースに移動し、キーワードdepressionを検索します。うつ病に関連する遺伝子標的を取得した後、電子スプレッドシートをダウンロードし、平均よりも高い遺伝子スコアを除外し、うつ病関連標的のリストを作成します。次に、生成ツールにアクセスし、化合物ターゲットに続いて疾患ターゲットファイルをアップロードします。化合物の推定標的と疾患標的の間の重複する遺伝子をプロットします。次に、図の画像をダウンロードします。最後に、文字列データベースにアクセスし、重複する遺伝子、特にQiangzhifang抗うつ重複ターゲットリストを名前のリストダイアログボックスに貼り付けます。生物セクションでホモ・サピエンスを選択し、「検索」をクリックし、「続行」をクリックします。タイトルバーからエクスポートオプションを選択し、タンパク質間相互作用ネットワークの概要表をPNGおよびTSV形式でダウンロードします。28日後のスクロース選好テストでは、慢性拘束ストレス群は対照群よりもスクロース選好度が有意に低かった。一方、Qiangzhifangとフルオキセチン治療群はどちらも、ストレス群と比較して有意に高い値を示しました。体重増加は、28日後に対照と比較して慢性拘束ストレス群で有意に減少しましたが、ストレス群と比較してQiangzhifangおよびフルオキセチン群で有意に増加しました。オープンフィールド移動プロットは、ストレスグループで中心領域の探索の減少を示しました。どちらの治療グループも目に見えてより中枢的な活動を示しました。オープンフィールドテストで移動した総距離は、すべてのグループで有意差は見られませんでした。中心領域での時間もストレス群で有意に減少し、両方の治療群で有意に増加しました。さらに、強制水泳テストの不動時間はストレス群で高く、両方の治療で有意に減少しました。

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