AAV2のくも膜下注射によるマウス新皮質ニューロンの広範な形質導入

私たちの研究は、マウスの新皮質で大量の神経組織をウイルス形質導入できる方法の開発に焦点を当てています。通常、ウイルス粒子の懸濁液は脳実質に直接注入されます。ここでの領域トランスフェクションは、限られた範囲を持つ脳組織内のウイルス粒子の拡散によって決定されます。

AAV2ウイルスベクターウイルスを脳表面を介してくも膜下腔に注入します。くも膜下ウイルス投与により、実質内注射と比較して感染面積がほぼ4倍に増加することがわかりました。この新しい技術は、成体マウスの新皮質ニューロンの広範な形質導入を提供し、その後のニューロン活動の光学的または電気生理学的記録のために脳組織を保存するのに役立ちます。

私たちの注入法は、強力な非選択的プロモーターを使用した場合でも、大きな集団層の5つの錐体型ニューロンで導入遺伝子を選択的に発現させることができます。しかし、そのような選択性のメカニズムは完全には理解されていません。まず、麻酔をかけたマウスの前歯を歯のバーに固定し、動物マスクを取り付けます。

マウスをイヤーバーに慎重に置きます。目から耳の後ろまで頭を剃り、剃った表面を70%エタノールで拭き、続いて5%アルコールのヨウ素溶液で拭きます。滅菌4%リドカイン溶液を局所的に塗布し、0.02ミリリットルのデキサメタゾンを皮下注射して、痛みと炎症を軽減します。

滅菌メスとハサミを使用して、耳の間から始まる4〜5ミリメートルの正中線切開を行い、頭皮を開きます。頭蓋骨の損傷を避けるために、はさみを使用して切開部を広げます。頭蓋骨の表面を3%過酸化水素でスワブして、ブレグマとラムダを視覚化します。

0.9%塩化ナトリウム生理食塩水で反応を直ちに停止します。次に、骨スクレーパーを使用して頭蓋骨表面から組織を取り除きます。事前に準備された電動インジェクターをハミルトンシリンジで定位固定アームに取り付けます。

手術用光源を使用して露出した頭蓋骨を照らし、顕微鏡をブレグマに焦点を合わせます。顕微鏡を通して観察し、定位アームを操作して、針の先端をブレグマの真上に合わせます。針の先端を使用してブレグマとラムダを水平に揃えます。

ブレグマに戻り、座標を記録します。計算された座標に針を移動します。新しい位置に下げてマークを付けます。

ウイルスの拡散を考慮しながら、ターゲット付近のウイルス注入部位を選択します。次に、直径0.5〜0.8ミリメートルの滅菌歯科用バリを使用して、顕微鏡で観察しながら小さな開頭術を作成します。加圧空気を使用して骨粉を吹き飛ばします。

滅菌生理食塩水で穴を浸し、綿棒で余分な部分を取り除きます。次に、硬膜を損傷しないように注意しながら、フック状の先端または細いピンセットが付いた27ゲージの針を使用して、残りの骨を取り除きます。滅菌生理食塩水で湿らせたペーパータオルで頭蓋骨を覆います。

次に、頭蓋骨表面の上に滅菌透明フィルムを置きます。定位固定アームを後ろに動かし、マイクロシリンジ針を透明フィルムの上に合わせます。次に、2マイクロリットルが残るまで余分なオイルを分配します。

ウイルス注入量とさらに2マイクロリットルのウイルスを透明フィルムにピペットで移動させます。顕微鏡を通して、針先をウイルス滴の中心に下げます。次に、電動インジェクターを使用してマイクロシリンジにウイルスをロードします。

頭蓋骨から湿らせた紙を取り除き、綿棒でその部分を乾かします。定位固定腕と針を挿入部位の上に再配置します。次に、ウイルスを一滴滴分配して、針の詰まりを確認します。

先端がフック状の30ゲージの針を使用して、硬膜に小さなスリットを入れます。シリンジニードルを硬膜まで下げ、表面接触点に基づいて挿入深さを計算します。針を皮質に300マイクロメートルの深さまでゆっくりと挿入し、2〜3分間待ち、200マイクロメートルに引っ込めてさらに2〜3分待ちます。

毎分0.06マイクロリットルでウイルス注射を開始し、合計1マイクロリットルです。注入後、ウイルスを拡散させるために、針を標的部位に10分間保持します。次に、逆流を避けるために針をゆっくりと引っ込めます。

ウイルスを一滴垂らして、針が詰まっていないことを確認します。5-0吸収性または非吸収性縫合糸を使用して頭皮切開部を閉じます。AAV2 のくも膜下投与は、従来の皮質内注射と比較して神経細胞感染の領域が有意に大きくなり、内外側方向と吻尾方向の両方でほぼ 4 倍に拡大しました。

くも膜下ウイルス注射により、皮質層2、3、および5のニューロンに強い緑色の蛍光標識が見られましたが、層4と6は標識された細胞体を示さなかったが、それぞれ目に見える樹状突起と軸索を示しました。くも膜下注射中に注射されたウイルス懸濁液に添加された蛍光粒子が脳表面に沿って見られ、ウイルスが脳脊髄液を介して拡散していることを示し、神経細胞の標識よりも広い表面範囲を被っています。前頭切片における緑色蛍光の大きな表面分布は、標準的な注射で見られる小さな局所感染とは対照的に、くも膜下注射後の広範な皮質感染を確認しました。

超粒状層では、形質導入されたニューロンのかなりの割合がパルブアルブミンまたはカルビンジンを共発現させましたが、第5層では共標識介在ニューロンは検出されず、すべての感染細胞は錐体ニューロンによってのみ表されました。