化合物巨大ユニラメラ小胞の合成:核細胞の生体模倣モデル

この記事では、小胞内構造を持ち、内側、環状、および外側の領域で電気伝導性がカスタマイズされた化合物ジャイアントユニラメラベシクル(cGUV)を調製する方法を紹介します。電気形成は単純なGUVを合成し、浸透圧ショックによって気孔細胞やcGUVに変換されるため、有核細胞の生物物理学を研究するための貴重なモデルを提供します。

私たちは、化合物の巨大単層小胞の合成と電気流体力学について精巧な研究を行い、真核細胞の生体磁気等価物として確立しました。細胞エレクトロポレーションや細胞電極変形など、生体細胞に電場を印加する技術を理解する試みです。

この分野の研究を進めるために、蛍光顕微鏡と光学顕微鏡、ナノ秒パルス電気処理、オシロスコープと電源、および革新的な合成方法の組み合わせが採用されています。温度、脂質の種類、および使用される組成に対する方法の感度における、良好な形状の化合物GUVの合成における課題。この研究では、DMPCとコレステロールシステムについてこれを実証しますが、一般化することは依然として困難です。核細胞を模倣する単純なGUVが文献で合成されています。複合巨胞を合成して、弁防御構造を持つ有核細胞を模倣し、外側の小胞の約半分の大きさの内側の小胞を囲みます。

エレクトロポレーションの文脈における生体細胞の核の模倣である内胞に対するマイクロおよびナノ秒パルスの効果の研究に焦点を当てます。

[ナレーター]まず、食器用洗剤溶液を使用して酸化インジウムスズまたはITOコーティングされたスライドを徹底的に洗浄し、導電率0.055マイクロシーメンス/センチメートルの脱イオン水ですすいでください。次に、100%エタノール溶液を使用して、スライドを再度洗浄し、脱イオン水ですすいでください。スライドを摂氏85度に設定したオーブンで乾燥させます。クランプメーターを使用して、各ITOコーティングされたスライドの導電面を特定します。掃除機を使用してクリーンスライドをスピンコーダーステージに固定し、導電側が上を向くようにします。25マイクロリットルの脂質溶液を1つのITOスライドの導電側に4液滴ずつ塗布します。別のスライドを取り、25マイクロリットルの脂質溶液を同じ方法で2回塗布します。脂質コーティングされた両方のスライドを、暗所で保管したデシケーターで最低2時間真空乾燥させます。次に、脂質でコーティングされたITOスライドと脂質スライドをきれいなスライドと平行に配置し、導電面が向かい合うようにし、それらの間に厚さ3ミリメートルのシリコーンゴムスペーサーを配置します。セットアップをクランプで密閉し、電鋳チャンバーを作成します。次に、2ミリリットルの注射器を使用して、チャンバーに100ミリモルのショ糖溶液を満たします。ファンクションジェネレータの出力ケーブルを、ファンクションジェネレータでITOコーティングされたスライドに接続します。両方の電鋳チャンバーを摂氏38〜40度に維持されたインキュベーターに入れます。デュアルチャネルファンクションジェネレータを使用して、10ヘルツ周波数で5ボルトのピークツーピークの交流電界を4時間印加します。インキュベーション後、電形成チャンバーをファンクションジェネレータから外します。それらをインキュベーターから取り出し、室温まで冷まします。シリンジを使用して、合成された巨大な単層小胞を各チャンバーから採取し、別々の2ミリリットルの微量遠心チューブに移します。浸透圧ショックに進む前に、チューブを摂氏25〜27度の室温で1時間インキュベートします。100ミリモルのスクロース溶液を含む水和培地に懸濁した200マイクロリットルの単純な巨大単層小胞(sGUV)を観察チャンバーに移し、125マイクロリットルの300ミリモルグルコース溶液を導入して浸透圧ショックを誘発し、形状遷移を開始します。浸透圧ショックを受けているsGUVを、顕微鏡ステージに配置された観察チャンバー内で1時間休ませます。単色カメラを搭載した倒立顕微鏡を用いて、微分干渉コントラストと落射蛍光顕微鏡を行います。Plan Fluorの超長作動距離20倍×0.45および40倍×0.60対物レンズを使用して、sGUVの形状変化を観察します。落射蛍光には、510〜560ナノメートルの励起を持つグリーンフィルターセット、575ナノメートルのダイクロイックミラー、および590ナノメートルのバリアフィルターを使用して、ナイルレッド染色二重層を使用します。Plan Fluor対物レンズを使用した微分干渉コントラストおよび落射蛍光顕微鏡を使用して、観察チャンバー内の形状遷移を監視します。形状遷移が進行するにつれて、ストマトサイト小胞の形成を観察します。大きな小胞が最初にどのように沈降し、次に時間の経過とともに小さな小胞の数が増加するかを監視します。次に、浸透圧ショックを誘発する前に、塩溶液を加えてcGUVのさまざまな領域の導電率を調整します。たとえば、環状領域よりも外側と内側の領域で高い導電率を生み出すには、200マイクロリットルのスクロース溶液を電気融合チャンバーに移します。20マイクロリットルの7.5ミリモル塩溶液をチャンバーに加え、125マイクロリットルの300ミリモルグルコース溶液で浸透圧ショックを誘発します。浸透圧ショックsGUVをチャンバー内で3〜4時間休ませます。得られたcGUVは、環状領域と比較して外側領域と内側領域でより高い導電率を有することを確認します。 cGUVの電極変形を行うには、ワイヤ電極を500マイクロメートル離し、ファンクションジェネレータを使用して100キロヘルツで7.5ボルトのピークツーピークの交流電位を印加します。電界を印加した後、毎秒10フレームでビデオをキャプチャし、外側の小胞の扁平変形と内側小胞の長状変形を観察します。次に、cGUV混合物をキャビティスライドにロードし、動きを防ぐためにカバースリップでシールします。レーザー走査型共焦点顕微鏡を使用して、1マイクロメートルのステップサイズでZ軸走査によりcGUVの形態を解析します。イメージングにはプランアポクロマート40X x 1.3オイルDIC対物レンズを採用。561ナノメートルの励起と561〜695ナノメートルの発光を持つ赤色シングルチャンネルモードを使用して、ナイルレッドまたはローダミンPEで染色されたcGUVを画像化します。を変更して抽出します。顕微鏡リンクソフトウェアを使用したCZI画像ファイル。縮尺記号などのグラフィックを挿入し、2D および 3D ビューを有効にします。次に、処理方法とパラメータに移動して、目的の設定を調整します。次に、[適用] をクリックして、画像を JPG 形式でエクスポートします。最後に、ImageJソフトウェアでファイルを開きます。スケール バーを挿入するには、[分析] に移動し、次に [調整するスケールの設定] を選択し、[分析] を選択し、次にツールとスケール バーを選択して適用します。共焦点Zスタックイメージングにより、内側の小胞が外側の小胞から完全に分離され、内側の溶液の密度が低いため、Z面で上昇していることが確認されました。中間の口造膜状態は、完全に分離する前に、内側と外側の小胞をつなぐ狭い首を示しました。浸透圧ショックの6時間後に、複数の内小胞、星形体、管状構造など、多様な小胞形態の集団が観察されました。1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリンとコレステロールの脂質混合物を63〜37モル比で使用して、大量のcGUVが形成されました。交流電界下では、cGUVは変形を示し、外側の小胞は扁平な形状を形成し、内側の小胞は長方形を形成しました。