線維症を伴う代謝機能障害関連脂肪性肝疾患のマウスモデル

本研究では、代謝機能障害関連脂肪性肝疾患(MASLD)に焦点を当て、特に脂質蓄積と線維化のメカニズムに注目しています。最近の進展には、単細胞および特殊トランスクリプトミクス、MASLDの動物モデルの標準化、MASLD治療のためのセマグルチドの承認などがあります。MASLDには多くの動物モデルがありますが、肝線維症を誘発しないものも多くが分かりました。

そこで、その点に対応するために、私たちはMASLDのマウスモデルを開発しました。私たちのマウスモデルは、過食性マウスに平均的なアメリカ人の食事に似た食事を与えることで、線維症を伴うMASLDを誘発します。これにより、人間の病気と非常に似たMASLDを引き起こします。

この手法はMASLDの病態生理の研究や新しい治療法の検証を促進します。まず、スライド上でパラフィン埋め込みの肝組織切片を取得します。脱脂のためには、スライドをキシレンまたはシトリソルブに5〜15分間浸します。

その後、セクションを100%、95%、70%エタノールで連続的に再水和し、それぞれ5分間蒸留水を加えます。次にシリウスレッドで部分を染め、スライドを脱水させます。透明化液から1枚ずつスライドを取り出し、ペーパータオルで拭き取って余分な液体を落とします。

セクションに約50〜100マイクロリットルのマウントメディウムを加えます。カバースリップでその部分を覆い、そっと押して気泡を取り除きます。スライドを自然乾燥させます。

次に、4倍から20倍の対物レンズを使って明力場照明の光学顕微鏡で準備済みの部分を観察します。約500〜1000マイクロリットルの肝均質酸を1.5ミリリットルの遠心分離機管に移し、トリクロロ酢酸を加えて最終濃度12%にします。チューブ内で一時的にボルテックスをして内容物を混ぜます。チューブを氷水浴で30分間孵化し、6,000gで4度Cで10分間遠心分離します。

その後、ピペットで上澄液を除去します。ペレットを洗浄するために100%氷冷エタノールを1ミリリットル加え、ソニック処理して完全に再懸濁させます。懸濁液を再度遠心分離した後、上清液を吸引します。

3回目の洗浄後は、チューブを開けたまま10分以上自然乾燥させてください。次に、タンパク質ペレットを含むチューブに6種類の塩酸を800マイクロリットル加え、先ほど示したソニケーターでペレットを再懸浮させます。サスペンションをキャップ付きのガラス管またはバイアルに移し、キャップをしっかりと密閉します。

チューブを110度Cのオーブンで約22時間孵化させます。必要に応じて、ガラスバイアルから遠心分離機に中身を移してから回転させます。加水分解サンプルを16,000gで10分間遠心分離し、ヒドロキシプロリンを含む上澄液を1.5ミリリットルのチューブに吸引します。

ヒドロキシプロリン酸化には、50マイクロリットルの試料と標準物質を装填したチューブに450マイクロリットルのクロラミン溶液を加えます。チューブ内の内容物をボルテックスと混ぜ、室温で25分間孵育します。次に、各サンプルと標準物質に500マイクロリットルのエーリッヒ試薬を加えます。

渦巻きの後、サンプルを65度Cで20分間インキュベーターで培養します。培養後、チューブを室温まで冷やし、サンプルの最終的な色を観察します。最後に、550ナノメートルの波長で分光光度計を用いて試料や標準物質の吸光度を測定します。

ピクロシリウスレッドによる肝組織のコラーゲン染色は、明るい視野照明の下で観察すると、薄いオレンジまたは黄色の背景にコラーゲン赤色が見られました。線維症に対応するコラーゲン沈着や、血管壁、ヒラム、肝包にコラーゲンが染色されました。偏光顕微鏡では暗い背景に明確な複屈折コラーゲン線維が確認され、線維症の可視化が促進されました。

高脂肪果糖食事(HFFD)を投与したアグーティイエローマウスの肝コラーゲン陽性面積の定量では、低脂肪・果糖食事を与えた野生型対照マウスと比較して有意に高い線維化が示されました。肝臓ヒドロキシプロリン含有量の定量により、HFFD食事を投与したアグーチイエローマウスは、16週間後の食事を行った対照マウスよりも有意に高いレベルを示し、線維化性肝臓におけるコラーゲン沈着の増加が確認されました。