ミニ脳卒中マウスモデルにおける神経免疫相互作用の単離とフローサイトメトリー評価

私たちの研究範囲は、虚血性脳卒中後の免疫細胞機能に焦点を当てています。脳卒中の病理における常在免疫細胞と浸潤免疫細胞の法則を理解することを目指しています。現在、フローサイトメトリーは、神経炎症における免疫細胞の機能と相互作用を評価するために広く使用されています。

さらに、免疫技術、単一細胞およびシーケンシングにより、神経免疫相互作用の研究が進んでいます。私たちの研究室は、神経免疫相互作用におけるアストロサイトの経路、神経炎症プロセスへの血管の寄与を説明することに焦点を当てます。まず、50ミリリットルの注射器を取り、その端に26ゲージの針を取り付けます。

注射器に生理食塩水を完全に充填します。麻酔をかけたマウスを発泡ボード上に仰臥位で配置します。前肢と後肢を伸ばし、26ゲージの針で固定します。

鋸歯状の親指鉗子を使用して、腹部の皮膚をつかみ、横方向の切開を行い、肝臓を露出させます。肋骨の両側に沿ってカットしてハートを露出させます。次に、26ゲージの針を左心室に挿入し、右の神託を切断します。

シリンジプランジャーを押して、血液を排出します。オラクルから排出される血液が透明になるまで灌流を続けます。マウスの首を切って脳を抽出した後、マウススチールブレインマトリックスに移し、連続した2ミリメートルの厚さの角膜スライスに切断します。

500マイクロリットルの消化酵素混合物を12ウェルプレートの各ウェルに導入します。マイクロ鉗子を使用して、梗塞組織を繊細に分離し、消化酵素混合物に移します。最後に、眼科用ハサミで組織を可能な限り小さな断片に断片化し、プレートを摂氏37度で20分間インキュベートします。

AP 1000ピペットを使用して、溶液を10回穏やかに吸引して分注し、組織を個々の細胞に解離させます。次に、溶液を70マイクロメートルのセルストレーナーに通します。12ウェルプレートとセルストレーナーの両方を、カルシウムとマグネシウムを含む氷冷HBSSで繰り返しすすぎます。

次に、収集した細胞懸濁液を摂氏4度で5分間500Gで遠心分離します。ペレットを乱さずに上清を慎重に廃棄します。ペレットを1ミリリットルのPBSに再懸濁します。

遠心分離プロセスを繰り返した後、ペレットを150マイクロリットルのPBSに再度再懸濁し、懸濁液を96ウェルの丸い底板に移します。摂氏4度で5分間、500Gで再度遠心分離します。遠心分離後、96ウェルプレートをしっかりとつかみ、素早く反転させて上清を捨てます。

次に、細胞生存率蛍光ダイをPBSで1〜100の比率で希釈し、希釈した色素溶液の150マイクロリットルにペレットを再懸濁します。プレートを光から保護しながら、室温で10分間インキュベートします。摂氏4度で5分間遠心分離した後、上清を廃棄します。

細胞表面抗体カクテルを磁気活性化細胞選別または最大バッファーで希釈し、細胞を洗浄せずに抗体カクテルをウェルに加えます。摂氏4度で15〜20分間インキュベートしてから、さらに5分間遠心分離します。プレートを遠心分離し、上清を廃棄した後、ペレットを150マイクロリットルの最大バッファーに再懸濁します。

懸濁液を1.5ミリリットルの遠心分離管または5ミリリットルの丸底ポリスチレン試験管に移します。手動の方法またはオンラインのパネル設計ツールを使用して、機器構成に従ってマルチカラーフローサイトメトリーパネルを設計します。細胞生存率色素をパネルに含めて、データから生体不明の細胞や破片を除外します。

前方散乱検出器と側面散乱検出器の設定を調整して、目的のセルが正しく表示され、適切にゲートできるようにします。FSCおよびSSCパラメータを微調整して、破片や無関係なノイズを除去します。FSC面積と高さを示すドットプロットで、ダブレットとシングルセルを区別します。

生存色素の陰性シグナルを使用して、生存細胞を単離します。未染色細胞の自家蛍光コントロールと染色細胞陽性コントロールを比較して、染色細胞が各パラメーターに対して適切にスケーリングされていることを確認します。マルチカラーセルサンプルを解析し、2つのカラードットプロットを調べることで、補正を微調整します。

細胞集団が互いに垂直または水平に整列するまで、補正設定を上下に調整します。CD45 および CD11B シグナルを利用して、特定の発現パターンに基づいてリンパ球、ミクログリア、骨髄細胞、星状細胞を区別します。リンパ球を同定するための基準として機能する自家蛍光制御として偽の脳組織を使用します。

特定のターゲットを分析する場合は、脳卒中後の脳組織でFMOコントロールを利用します。制御データを収集して保存します。同様に、サンプルデータを収集して保存します。

標的細胞集団を選択し、5ミリリットルの丸底ポリスチレン試験管または15ミリリットルの円錐形遠心分離管のいずれかに分類します。500マイクロリットルのPBSを加え、収集チューブをすすぎ、細胞の生存率を維持し、ペレット形成を助けます。CCR7陽性およびCD11c陽性のミクログリアは、虚血性脳卒中後2日目と7日目に定量化されました。

ミクログリアにおけるCCR7発現は、偽対照と比較して2日目に急激に上昇し、7日目に上昇したままでした。CD11c陽性ミクログリアも同様の傾向をたどり、2日目にピークに達し、7日目には偽よりも高いままでした。ドットプロットは、2日目と7日目に密なCCR7およびCD11cシグナルを示しました。

偽制御におけるスパース信号との対比ゲーティング戦略はCD11BとCD45発現を用いてミクログリア骨髄細胞とリンパ球を分離した追加のマーカーは、生細胞、星状細胞、およびリンパ球サブセットを定義しました。