哺乳類細胞におけるGodanti Bhasmaによって引き起こされる食作用の連続的な細胞イベントの探索

食作用、つまり食細胞が異物を摂取して分解する場所。免疫防御にとって非常に重要です。この複雑な細胞プロセスを効率的に監視および評価するには、ユーザーフレンドリーな方法を改善する必要があります。

リアルタイムの分解イベントをキャプチャし、光漂白によるアーティファクトを回避することは、食作用と細胞内輸送を正確に研究する上で依然として重要な課題です。蛍光粒子や合成粒子とは異なり、私たちのプロトコルは、光漂白、最適化、または複雑な調製を行わずに食作用段階を直接視覚化できるラベルフリー粒子であるGodanti Bhasmaを使用しています。これらの発見は、食作用メカニズムを分析するための再現可能なモデルを提供し、小胞動態、病原体の機能不全、免疫およびリソソーム障害に対する潜在的な治療介入を研究するための新しいツールを提供します。

私たちは、成熟のファゴソームの分子調節因子を調査し、疾患モデルにおける食細胞機能障害を調査し、小胞動態と細胞内輸送を調節する潜在的な薬物をスクリーニングすることを目指しています。まず、ゴダンティ バスマまたは GB パウダーの正確な 100 ミリグラムの重さを量ります。10%FBSと1%ペニシリンストレプトマイシンを添加した10ミリリットルのDMEMに粉末を懸濁します。

懸濁液を完全にボルテックスして内容物を混合し、混合物を1分間放置して、大きな粒子が底に沈殿します。ピペットを使用して、懸濁液の上部5ミリリットルを滅菌遠心分離管に移します。5ミリリットルの移されたGB懸濁液を、さらなる細胞培養作業のためのストック溶液としてラベル付けします。

懸濁液を細胞に添加する前に、粒子が均一に分散するように、懸濁液を再び完全に渦に巻き込みます。3 10の4乗3T3-L1細胞を、2ミリリットルのDMEMを含む35ミリメートルの皿に播種します。細胞が70%コンフルエントに達するまで、5%の二酸化炭素の雰囲気中で37°Cで皿をインキュベートします。

次に、300マイクロリットルのGBストック懸濁液を2ミリリットルの予熱した新鮮な培地に完全に混合します。細胞とGB懸濁液を含む培養皿をイメージング顕微鏡のステージインキュベーターに置きます。顕微鏡で10倍対物レンズを選択します。

明るいボタンを使用して明視野照明をオンにします。次に、DIGI ImagePlusソフトウェアを起動し、適切なカメラを選択します。[キャプチャ] ボタンをクリックし、タイムラプス オプションを選択します。

インターバル時間を5分に設定し、 終了 ボタン。顕微鏡ステージの二酸化炭素インキュベーター内で16〜24時間連続して5分間隔で明視野画像をキャプチャします。ImageJソフトウェアを使用して、キャプチャしたすべての画像をタイムラプスビデオにコンパイルします。

これにより、粒子の内在化から完全な分解までの食作用段階を同定することができます。96ウェルプレートで24時間細胞増殖した後、GB粒子ストック懸濁液を完全に混合します。各ウェルに30マイクロリットルの懸濁液を加えます。

GB粒子を含まないウェルをネガティブコントロールとして使用します。プレートを摂氏37度で5%二酸化炭素中で24時間インキュベートして、液胞形成を誘導します。中性赤色溶液を調製するには、中性赤色を溶解して、血清遊離DMEMで0.5ミリリットル/ミリリットル溶液を作ります。

0.2マイクロメートルのフィルターで溶液をろ過します。イメージングのために、96ウェルプレートから培地を取り出します。各ウェルに60マイクロリットルのフィルター色素を加えた後、プレートを摂氏37度で15分間インキュベートします。

余分な染料を除去するために、PBSでウェルを3回洗浄します。次に、顕微鏡イメージングに進みます。20倍の対物レンズを使用して顕微鏡で染色された液胞を調べ、液胞のサイズ、形態、および数を評価します。

バフィロマイシンA1ストック溶液を調製するには、100マイクログラムの化合物を50マイクロリットルのジメチルスルホキシドに溶解します。次に、950マイクロリットルのDMEMで希釈します。作業溶液の場合、1マイクロリットルのストックを1.6ミリリットルのDMEMで希釈して、0.1ナノモルの最終濃度を得る。

作業溶液を完全に混合し、96ウェルプレート内の細胞を含むウェルに100マイクロリットルを加えます。次に、各ウェル内の細胞を30マイクロリットルのGB粒子懸濁液でインキュベートして、液胞およびファゴソーム形成の阻害を研究します。ファゴソーム酸性化を阻害するには、100マイクロリットルのバフィロマイシンA1作業溶液を、以前にGBで処理された予め形成された液胞を含むウェルに加えます。すべてのウェルを摂氏37度で5%二酸化炭素中で24時間インキュベートします。

各ウェルに60マイクロリットルの中性赤色染料を加えます。摂氏37度で15分間インキュベートし、ウェルをPBSで3回洗浄して余分な色素を除去し、顕微鏡下で液胞の形成と酸性化を分析します。培養細胞を50マイクロリットルのGB懸濁液で処理し、標準的な実験条件下で摂氏37度で5%二酸化炭素で一晩インキュベートします。

処理後、1ミリリットルあたり1ミリグラムの濃度のアクリジンオレンジ溶液を細胞に加え、摂氏37度で15分間インキュベートして液胞と酸性小胞細胞小器官を染色します。次に、細胞を滅菌PBSで3回洗浄して、結合していない色素を除去し、バックグラウンド蛍光を減らします。最後に、20倍の対物レンズと450〜492ナノメートルの青色励起フィルター範囲を取り付けた蛍光顕微鏡を使用して、染色されたスライドをすぐに分析します。

液胞動態を理解するために、細胞形態とアクリジンオレンジの取り込みを評価します。GB処理を30分間行った後、3つの3T3-L1細胞の表面に粒子が付着していることが観察されました。粒子の周囲にカップのような膜の伸びが現れ、粒子の巻き込みの開始を示しました。

処理後12時間で、GB粒子を含む大きな膜結合液胞が細胞内に観察されました。タイムラプスイメージングは、4.75時間にわたって単一の生細胞における段階的な内在化と液胞形成を示しました。液胞内のGB粒子は時間の経過とともに徐々に分解され、細胞は液胞の代謝回転によって示されるように正常な形態を取り戻しました。

フローサイトメトリー分析により、内在化されたゴダンティバスマ粒子は24時間以内に完全に分解され、培地に粒子は残らないことが示されました。中性赤色染色では、弱いリソソーム染色のみを示した対照と比較して、3つの細胞株すべてのGB処理細胞で有意に高い液胞酸性化が明らかになりました。アクリジンオレンジ染色は、酸性化を示すGB 3T3-L1細胞の液胞にオレンジ赤色の蛍光を示しましたが、未処理の細胞は緑色の蛍光のみを示しました。

バフィロマイシンとの同時処理は、それぞれの対照と比較して液胞がないことによって証明されるように、3T3-L1 細胞と HeLa 細胞の両方で液胞形成を阻害しました。バフィロマイシンによる処理後、中性の赤色の取り込みが効果的にブロックされ、細胞内の液胞の酸性化と成熟が妨げられました。