河畔および水生甲虫の分子運用分類単位(MOTU)を生成するための調合パイプライン

MEGAの多様な熱帯地方での種の発見をスピードアップすることを目指し、このプロトコルは、コンピューターベースの分析を組み合わせて、水生および河岸のカブトムシの種クラスタリング仮説を生成することを目的としています。

COI DNA配列を利用したこの調合パイプラインは、以前は形態学的データのみを使用して構築されていたアニソステナ属のラフティングカブトムシの種の境界に関するより大きな証拠をもたらしました。

このプロトコルは、昆虫系統学のゴールドスタンダードと考えられている形態学ベースの分類学による種の発見が、十分に研究されていないが、MEGAの多様で非常に目立たない水生カブトムシにとって、しばしば時間がかかり、混乱を招くという分類学的障害に対処することを目的としています。

[エマニュエル]このパイプラインは、配列が参照配列ごとに既知の種に対応しているかどうか、または種が未発見または記述されていないかどうかに関係なく、MOTUと呼ばれる分子付属仮説を生成します。

これにより、パイプラインは、一度に何百ものカブトムシの生殖器構造を解剖して比較するのではなく、標本の同種性を精査できる予備的なクラスタリングを提供します。

[ナレーター]まず、MEGA Xを起動し、アライメント用のDNA配列をロードします。線分を選択し、[線形の編集または構築]をクリックして、[新しい線形の作成]を選択して、線形インターフェイスを開きます。[OK] をクリックして選択を確認し、データ型として [DNA] を選択します。編集タブの上にマウスを置きます。ファイルからシーケンスを挿入をクリックします。適切なディレクトリに移動し、MEGAにロードするシーケンスファイルを選択します。次に、[alignment] をクリックし、[Align by ClustalW] を選択してデフォルト設定を使用してシーケンスを整列し、[OK] をクリックして続行します。シーケンスを手動で編集するには、挿入されたベースまたは位置をクリックし、キーボードの Delete キーを押して、挿入を削除します。次に、欠落しているベースを表すダッシュをクリックして削除し、目的のベースを入力して削除を修正します。次に、すべてのシーケンスに文字が含まれている最も古い位置を見つけます。この位置のすぐ左側にある行ヘッダーの空白ボックスをクリックし、ドラッグして余分な開始位置をすべて選択します。Delete キーを押してトリミングします。次に、最後に位置合わせした位置を見つけて、この点の右側にあるボックスをクリックします。もう一度 Delete を押して、端をトリミングします。次に、すべての配列を選択し、翻訳されたタンパク質配列タブをクリックします。プロンプトが表示されたら、遺伝暗号が無脊椎動物のミトコンドリアであることを確認します。遺伝暗号が異なる場合は、「いいえ」をクリックするとメニューが表示され、無脊椎動物のミトコンドリア遺伝暗号のボックスにチェックを入れることができます。アライメントのアスタリスクでマークされた終止コドンが列全体に表示される場合は、DNA配列をクリックし、すべての配列の最初の位置を削除します。もう一度、DNA配列をクリックし、アライメントを.mosまたは.mosx形式で保存します。TaxonDNAモジュールを使用して区切りを開始するには、TaxonDNAソフトウェアを開きます。インポートをクリックし、FASTAを選択して、FASTA形式でアライメントファイルをアップロードします。次に、モジュールをクリックし、クラスターを選択します。しきい値を 3% に設定し、[すべてのクラスターで個別情報を生成する] というラベルの付いたボックスをオンにします。[今すぐクラスターを作成] をクリックしてクラスタリングを開始し、スクリーンショットを撮って結果を保存します。木村2パラメータ法を使用して区切りを行うには、MEGAを開いてファイルをクリックし、ファイルまたはセッションを開くを選択します。距離をクリックします。ペアワイズ距離の計算を選択し、区切りの .meg ファイルを確認します。モデルまたはメソッドの横にあるボックスにカーソルを合わせ、矢印をクリックしてドロップダウンメニューを展開します。Kimura 2パラメータモデルを選択し、[OK]をクリックしてプログラムを実行します。データ出力ウィンドウを開いて結果を表示します。ファイルをクリックし、エクスポートを選択して距離を印刷し、結果を保存します。自動パーティション分割またはASAP Webサーバーでアセンブル種を開きます。「ファイルを選択し」というラベルの付いたオレンジ色のボックスをクリックし、.fasta ファイルをアップロードします。下にスクロールして [移動] をクリックします。クラスタリング結果をダウンロードするには、ASAP スコアが最も低く、P 値ランクが最も高い行のリストをクリックします。次に、木の推定を開始するには、MEGAを開き、データをクリックします。次に、[ファイルまたはセッションを開く] を選択して .meg ファイルをロードします。モデルをクリックし、最適なDNAおよびタンパク質モデルを見つけるまたはmlを選択して、最適な置換モデルを決定します。解析設定メニューの「OK」をクリックします。次に、ツリーを生成するには、系統発生をクリックし、最尤木の構築とテストを選択します。モデルまたはメソッドの横にあるボックスをクリックし、ドロップダウンメニューから適切なモデルを選択して、最適な置換モデルを使用します。系統発生テストで、系統発生のテストの横にあるボックスをクリックし、ドロップダウンメニューからブートストラップ方法を選択します。ブートストラップレプリケーションの数の横にあるボックスをクリックします。「1,000」と入力して [OK] をクリックして解析を実行します。結果のツリーを含むウィンドウが開いたら、セッションを .mts または .mtsx ファイルとして保存します。また、出力を .newick ファイルとして保存し、ツリーを.png画像としてエクスポートします。PTP ベースの区切りについては、PTP Web サーバーにアクセスしてください。[ファイルを選択]をクリックし、ツリーをNewick形式でアップロードします。私のツリーの下ではルートが選択されています。 外群分類群名の下のボックスに、分類群の先端の名前を入力して外群を入力します。次に、[最尤解] で [区切り結果のダウンロード] をクリックして、PTP ML 出力を保存します。同様に、最高のベイズ サポート ソリューションで、区切り結果のダウンロードをクリックして PTP BI 出力を保存します。MPTP による MPTP ベースの制限については、MPTP Web サーバーにアクセスしてください。Newick ファイルを灰色の四角形にドラッグするか、四角形をクリックしてアップロードします。データが読み込まれたら、[外グループ選択に進む] をクリックします。外群の仕様ページで、外群標本の分類群ラベルの横にあるチェックボックスをクリックして、外群を選択します。次に、モデル選択をクリックし、MPTP を選択し、視覚化オプションをクリックします。視覚化オプションページで、デフォルト設定を受け入れます。送信をクリックします。ダウンロード可能なファイルの下のファイルを右クリックし、[名前を付けて保存]を選択して結果を保存します。次に、分子操作分類単位またはMOTUを生成するには、写真編集プログラムまたはPowerPointを使用してツリーを開きます。各分子種の区切りアプローチの結果を表すバーを作成します。すべてのアプローチで特定の分子クラスターに対して同じ結果が得られる場合は、コンセンサスによってクラスターを MOTU として指定します。この図は、COI 3素数配列と6つの区切り方法に基づくボラヌスカブトムシの最尤遺伝子ツリーと分子クラスタリングの結果を示しています。すべての方法では、4つのMOTUS、Byrrhinus negrosensis、Byrrhinus villarini Byrrhinus A、およびByrrhinus Bが一貫して同定され、方法間で同じクラスタリングが行われました。Byrrhinus negrosensisとByrrhinus villariniは、同じ場所に由来するにもかかわらず、明確に分離されていました。4つの州からの配列はByrrhinus Aにグループ化され、強い地理的構造は示されませんでした。この図は、アニソステナカブトムシがアニソステナアンガットブハイ、アニソステナ補助、アニソステナA、アニソステナBを含む4つのMOTUSにクラスター化され、方法間で完全に一致していることを示しています。アニソステナ・アキシリウムは、アニソステナAおよびアニソステナBと地理的に重複しており、地理だけでは分子の分散を説明できないことを示しています。