インビボ 麻酔をかけていない ショウジョウバエ の成虫の神経活動のイメージング

私たちは、脳が認知の柔軟性を維持するために記憶を積極的に消去または抑制する方法を明らかにすることを目指し、自然な記憶忘却の分子的、細胞的、回路の基盤を理解しようとしています。最近の研究では、忘却は単なる記憶の受動的な減衰ではなく、特定のパターンのニューロン活動を必要とする高度に制御された能動的な生物学的プロセスであることが示されています。

大きな課題は、コネクトーム、遺伝、行動データを厳密かつ解釈可能な方法で統合しながら、特定の回路操作を動的記憶プロセスに結び付けることです。私たちは、忘却が生物学的に制御された活発なプロセスであることを確立するのに役立ちました。私たちの研究は、ショウジョウバエの脳における正常な忘却に必要な特定のドーパミン作動性ニューロンと分子経路を特定しました。私たちのプロトコルは、麻酔なしでハエの機能イメージングを可能にし、麻酔薬による望ましくない非特異的影響を防ぎます。このアプローチを使用して、記憶形成と能動的記憶忘却の根底にある神経相関関係を調査します。

[ナレーター]まず、Dremel ツールとダイヤモンド鋸刃を使用して、22 ゲージの皮下注射金属チューブを約 10 センチメートルの長さに切断します。Dremel 420 カットオフ ホイールを使用して、チューブの両端を研磨して、ハエのテングを収容できる滑らかできれいな開口部を作成します。切断したチューブを15ミリリットルの遠心分離管に巻き付けて、目的の湾曲した形状を形成します。次に、長さ 7 センチメートルの 12 ゲージの皮下注射金属チューブを切断します。次に、カミソリの刃を使用して、22 ゲージの金属チューブに合うように 2 マイクロリットルのピペット チップの端をトリミングします。12ゲージチューブをピペットチップのもう一方の端にはめ込みます。次に、少量のエポキシ樹脂と硬化剤を混ぜ合わせます。小さな金属チューブがピペットチップと接する接合部と、大きなチューブがもう一方の端に接続する接合部にエポキシを塗布します。アセンブリをマイクロマニピュレーターホルダーに接続し、必要に応じて角度を調整する前に、エポキシが一晩完全に硬化するまで待ちます。衝撃と臭気を吐露するピペットを作るには、ドレメルダイヤモンドツールを使用して、1 x 100ガラスピペットから3ミリリットルのマークで1ミリリットルを切り取ります。次に、厚さ 24.5/8 インチの 8 ミリメートル x 1 ミリメートルの小さな長方形のアクリル板をカットします。長方形のアクリル片に収まるように銅のショックグリッドをカットします。銅グリッドの両端に 2 本の電線をはんだ付けします。次に、銅のグリッドをアクリル片の上に置き、ハエの腹部と脚に合わせて少し曲げます。絶縁テープを使用して、銅グリッドをアクリル片に貼り付けます。次に、ホットグルーガンを使用してガラスピペットをショックグリッドに取り付け、まっすぐで中央に配置されていることを確認します。記録チャンバーを構築するには、ガラス顕微鏡スライドをチャンバーベースとして使用します。樹脂とエポキシ接着剤を混ぜ合わせます。エポキシ接着剤を使用して、黒いアクリルチャンバーの四隅すべてにネオジム磁石を取り付けます。接着された各磁石の上に追加の磁石を置きます。次に、新しく配置した磁石をエポキシを使用してスライドガラスに接着します。硬化中は、ペーパークリップでアセンブリを所定の位置に保持します。200マイクロリットルのピペットチップを吸引器から取り外します。ショウジョウバエの入ったバイアルに吸引器を挿入し、1,000マイクロリットルのピペットチップに1匹のフライを吸引します。200マイクロリットルのピペットチップを吸引器に戻します。次に、吸引器をそっと吹き飛ばしてフリックし、フライが200マイクロリットルのピペットチップの上部に頭から固定されるようにします。次に、解剖チャンバーをマニピュレーターホルダーに置きます。真空をフライ保持チューブに接続し、流量を毎分約500ミリリットルに調整します。次に、真空金属チューブを顕微鏡の視野の中心に移動します。ハエのテングをバキュームホルダーにそっと吸引します。マニピュレーターを調整して、ハエの頭をチャンバーの開口部に合わせます。直流電源をオンにします。プラチナ抵抗線を使用して、溶かしたミリスチン酸を塗布して、目と胸部をチャンバーに接着します。固定したら、真空チューブを外します。マニピュレーターを使用して記録チャンバーを真空接続から取り外し、チャンバーを逆さまにします。次に、プラチナ抵抗を使用してテングを下から接着します。すべてが接着されたら、直流電源をオフにします。次に、チャンバーを直立させます。チャンバーをスライドガラスベースに取り付けます。はさみで小さなテープを切り、ハエの頭の前後に置きます。ハエの頭が実験者を90度の角度で向くようにチャンバーを回転させます。解剖針で、目の側面に沿って垂直に切開します。チャンバーを水平に回転させます。次に、キューティクルを横切って水平に切り込みを入れます。次に、ハエの頭のてっぺんに100マイクロリットルの生理食塩水を追加します。鋭利な鉗子を使用してキューティクルウィンドウを取り除き、鉗子で残っている脂肪や気管を取り除きます。準備したフライを、レーザーと水浸対物レンズを備えた共焦点顕微鏡の顕微鏡ステージに置きます。 マイクロマニピュレーターを使用して、ショックグリッドと臭気ピペットの位置を調整して、フライがショックグリッド上に正しく配置されるようにします。コースz調整ノブを使用して、脳のz軸をスキャンし、関心のある脳領域を見つけます。フレームサイズを512 x 512ピクセルに設定します。カスタムメイドまたは市販の臭気伝達システムを使用して、目的のニューロンから記録を開始します。録画時間を2分に設定します。トレーニング前の応答を収集してから 5 分後に、臭気伝達システムを使用してトレーニング プロトコルを開始します。次に、トレーニング後約5〜15分後にトレーニング後の反応を記録します。カルシウム指示薬GCaMP6fと赤色蛍光タンパク質tdTomatoは、きのこ体のガンマおよびアルファダッシュ葉に突き出た樹状突起を持つきのこ体出力ニューロンで選択的に発現し、MB077Cスプリット-GAL4ドライバーラインを使用してニューロンを視覚化しました。キノコ体出力ニューロンの3-オクタノールに対するカルシウム応答は、麻酔なしの逆コンディショニングの5分後に有意に減少し、15分で抑制されたままでした。対照的に、4-メチルシクロヘキサノールに対するカルシウム反応は、トレーニング後 5 分で有意に増強され、15 分後も上昇したままでした。擬似カラー画像は、トレーニング前後に明確な蛍光変化を示しました。麻酔をかけたハエでは、CS+ に対するトレーニング後のカルシウム反応は部分的にしか減少せず、CS- に対する反応はベースラインと有意差はありませんでした。定量分析により、麻酔をかけたハエのトレーニング後に CS+ 反応が有意に低下したことが確認されましたが、CS- 反応は統計的に変化しませんでした。可塑性は、麻酔をかけたハエと比較して、麻酔をかけていないハエの方が有意に高かった。