再利用可能な肝臓画像診断ツール:肝生命内顕微鏡検査用の再利用可能な3Dプリントツール

この手法の全体的な目的は、リユーザブル肝臓イメージングツール(RHIT)を、特に肝臓研究において高品質で動的な生物学的データを取得するための画期的なツールとして紹介することです。従来の科学的手法は、マウスを制御された実験で研究し、行動観察、生理学的モニタリング、遺伝解析に依存してきました。これらの研究の複雑さは、しばしば一貫性のない、あるいは限定的なデータ出力をもたらします。

多くの実験は、低解像度の画像が一瞬閃くだけですぐにフェードアウトし、長期的な傾向や微妙な変化を捉えにくいなど、不完全または解釈が難しいデータに依存しています。RHITを導入し、肝臓研究およびそれ以上の分野で動的かつ高解像度のキャプチャを可能にします。私たちが実証する技術により、アクセスしやすい素材と広く利用可能な3Dプリンティング技術を用いたカスタムイメージングツールの製作が可能になります。

学術的かつ資源の限られた環境での使用を想定して設計されたこのアプローチにより、高解像度の生体内画像化をサポートするデバイスの迅速な開発と展開が可能です。私たちの再利用可能な肝臓イメージングツール(RHIT)は、肝臓の生命体内顕微鏡検査中の組織安定性を向上させるために開発されました。RHITのモジュール設計は様々なサイズのマウスに対応し、生理学的障害を最小限に抑えた動的代謝プロセスの拡張イメージングをサポートします。

RHITは、軽量、熱安定性、機械的耐久性を評価される熱可塑性のアクリロニトリル、ブタジエン、スチレン、ABSを用いて単一工程で製造されます。材料密度を調整することで、呼吸や心拍による動きを効果的に吸収し、画像のアーティファクトを減らし、鮮明さを向上させます。ABSの化学的不活性性と水の不溶性により、生物組織の利用可能性を確保し、効率的な洗浄と再利用を可能にします。

RHITを再現するには、3Dプロダクトデザインソフトウェアを使いましょう。この設計にはAutodesk Inventorが使用されました。Autodesk Inventorを開いて新しい標準部品を作成します。

適切な説明とともにファイルを保存してください。フロントプレーン上で「2Dスケッチ作成」機能を使ってRHITのスケッチを作成します。長方形アイコンをクリックし、その左下隅をスケッチ平面の原点に置きます。

最初の長方形の中にもう一つ長方形を描き、RHITのイメージングウィンドウを表します。寸法機能を使って両方の長方形に寸法を加え、すべての長さと幅が原点および互いに相対的に参照されるようにします。マウスのサイズに応じてRHITの寸法を調整してください。

RHITに厚みを加えるために外側の長方形だけを選択し、エクストルードツールでスケッチを押し出して中央に開口部を残します。押出されたRHITの下面を選択し、スタート2Dスケッチ機能を使って新しい2Dスケッチを始めます。ヒートパッドのポケットを定義するために長方形を描いてください。

このスロットに挿入するヒートパッドのサイズと厚さに基づいて、長方形の寸法を定義します。これらの測定値は、哺乳類の温度モデルを正確に把握するために使用する物理的なヒートパッドと一致している必要があります。寸法機能を使って必要な寸法を適用します。

2Dスケッチを終了し、カット押出ツールを使ってヒートパッド用の深い空洞を作るためにマテリアル除去を行います。必要に応じてズームインしてスケッチの正確な位置を合わせます。キャビティと同じ面に温度プローブの新しいスケッチを書き始めます。

「2Dスケッチを始める」をクリックし、円のアイコンを選択してください。円を平面に置き、それに応じて寸法を決めます。スケッチモードを終了してください。

押し出をクリックして円のスケッチを選択してください。押出モードでは、カット、押し出し、材料除去をクリックしてください。ポケットインサートのある顔の右側に円を置きます。

まだ中央に置く必要はありません。寸法を加えてRHITの厚さの中心に合わせます。押し出すクリック。

カット方向を示す矢印付きのポップアップが表示され、スルーオールオプションが表示されます。すべてを選択してマテリアル全体を切り抜き、その後「OK」をクリックします。押出モード終了。

窓の端にフィレットを追加するには、フィレットアイコンをクリックし、8つのシャープエッジをすべて選択してください。フィレットサイズを追加してフィレットモードを終了します。環境タブに移動して3Dプリントタブを選択し、3Dプリント用にモデルを準備します。

修正されていないRHITを印刷するには、図1Aまたは補助材料からSTLファイルを3Dプリンティング準備ソフトウェアにインポートしてください。「インポート」をクリックし、ファイルを選択し、「準備」を押してモデルを印刷可能なレイヤーにスライスします。対応する商用3Dプリンターを選び、印刷ボタンをクリックしてください。

印刷工程を監視してください。完成したら、必要に応じて慎重に印刷されたRHITを取り外して清掃してください。排莢後10〜15分待ってから手術と画像診断を開始してください。

顕微鏡の準備とRHITの利用。肝臓IBN用の従来の逆位置共焦点顕微鏡を用意します(図2A参照)。サンプルを収めるためにステージアダプターを挿入します。

このプロトコルには、35ミリの円形開口部と40ミリのカバーガラスを備えた特注の金属インサートが使用されました。画像撮影の前後でカバーガラスの両面を徹底的に清掃し、必要に応じて70%エタノールを使用してください。マウスサイズに基づいて適切なRHITをテープで固定するには、RHITの開口部を対物レンズと、イメージングカバースリップに平行に合わせ、金属インサートにテープを貼ってカバーガラスに貼り付けます。

画像の対象物を、面積上のサイズ、空間分解能、撮影時間(例えば25X/95水対物レンズ)に基づいて選択します。対物レンズをカバーガラスの近くに水平にします。濡れた窓にガーゼの帯をテープで固定します。

これにより組織の位置を調整し、他の腹部臓器から分離することができます。RHITはスロットにヒートパッドを挿入して予温し、図2GからHに示すようにRHITの隣接するヒートプローブを固定します。これにより、画像撮影中にマウスの体温が維持されます。腹部の被毛はヘアクリッパーや脱毛クリームで剃ってください。

毛の残留物を移動させ、露出した皮膚を70%エタノールで消毒してください。施設のIACUC要件に応じて、適切な手術部位の準備を確保するために、ベタジンとエタノールを交互にスクラブすることがあります。動物の手術前に麻酔の深さを再評価してください。

肋骨の下に、剣突から外科用ハサミで肋骨の下に2〜3センチメートルの水平三日月形の切開を開け、上腹部の左側外側で終わらせます。最初の切開の後、左葉を露出させるために筋肉層に小さな二次切開を慎重に行います。出血を防ぐために必要に応じて焼灼してください。

焼灼器使用中に肝臓への熱ダメージを防ぐために、肝臓と筋肉層の間に生理食塩水浸しガーゼを挟み、筋肉の発せられる熱を吸収します。過度の出血、外科的または機械的外傷、外部圧迫は避けてください。肝臓が露出したら、マウスを顕微鏡ステージに移します。

顕微鏡ステージ上のマウスの位置。麻酔を受けたマウスの腹部を顕微鏡のRHITプラットフォームの上に下向きに配置します。ネズミが麻酔下に置かれたままになるように鼻のコーンを調整してください。

生理食塩水に浸した綿先端のアプリケーターを使い、肝臓の左側葉をカバースリップに優しく押し付け、胸腔には外部圧力をかけます。重力を利用して、肝臓を慎重に外側に移し、カバーガラスの上に乗せてください。ガーゼの帯を使って、肝臓をネズミの体から優しく切り離します。

画像検査中もマウスが麻酔状態にあるか再度鼻のコーンを確認してください。露出した虫歯の縁に水性ジェルを塗布し、ヒートパッドへの直接接触を避けることで組織脱水を防ぎます。密閉型湿度チャンバーを備えた顕微鏡は、温度や湿度の維持にも役立ちます。

角膜乾燥を防ぐために眼科軟膏を塗布してください。最後に、タイムラプスIVMを設定して画像撮影を開始します。レーザーシャッターを開け、蛍光標識を評価し、血流が顕著な安定した関心領域を特定します。

フォーマット、速度、撮影間隔、撮影時間、フレーム平均など、適切な画像取得を選択します。必要に応じてZスタックの上限と下限を定義し、タイムラプス録画を開始します。プロトコルの検証のために、図3Dに示された構造類似指数(SIM)を用いて画像の安定性を定量化しました。

SIMは、輝度、コントラスト、構造パターンに基づいて2つの画像を比較します。1の値は完全な類似性を示し、0は歪みを反映します。図3Cは、RHITが挿入なしの最大50倍のSIM値を一貫して生成し、優れた画質を示しています。

AからCとラベル付けされた画像では、安定剤なしの肝IVM、段ボール挿入、RHITを比較しました。RHITはマゼンタ色の脂質滴、緑色の核、シアン色の血管の明確な解像度を維持します。白黒インセットは画像の安定性を強調します。

RHITはまた、肥満マウスで8時間以上長期的にIBMを可能にしました(映画1で示されています)。これらの結果を総合して、RHITが疾患間で画像の品質と再現性を大幅に向上させることが確認されました。総合すると、RHITは肝臓型IBMで従来必要だった複雑なセットアップを簡素化し、再現性とアクセスの両面を向上させます。

このアプローチは、高度なイメージングプロトコルの標準化に向けた3Dプリンティングの広範な動きを予見しています。肝臓画像診断を超えて、RHITの設計原則は臓器断層撮影、材料科学、工学など、動作安定性が画像精度に不可欠な他の応用にも拡張可能です。