液滴移動法による巨大単層小胞の確実な作製

私たちは、局所的に治療を行うために体組織を移動する細胞のようなマイクロロボットを目指しています。それらは巨大な単層小胞とリン脂質膜に基づいており、活性粒子を含んでいます。このプロトコルは、合成生物学やマイクロロボティクスなどの他の分野で液滴移動法を採用し、適応させたい初心者向けのガイドを提供します。

他の GUV 調製技術と比較して、このプロトコルは高いカプセル化効率と簡単な実行を備えているため、基本的な実験装置を備えたあらゆる研究グループが利用できます。GUVベースのマイクロロボットの組織様環境でのナビゲーションを評価し、センシング戦略を実装して、病変細胞への自律的な移動を可能にします。まず、グローブチャンバーをケミカルフードの内側または横に移動します。

グローブチャンバーを開き、シリカ粒子で満たされた晶析装置をチャンバーの底に置きます。晶析装置を白い支持面で覆い、ペーパータオルを重ねます。必要なすべての材料をグローブチャンバーに挿入し、クロロホルム溶液の入ったガラスバイアルをコルクリングホルダーまたは150ミリリットルのビーカーに、オペレーターの側にできるだけ近い位置に置きます。

次に、グローブチャンバーを閉じ、2つの半分がしっかりと位置合わせされ、滑らないようにします。付属のプラスチックネジを使用してチャンバーを完全に密閉します。出口バルブを閉じ、5番パイプを半分水で満たされた500ミリリットルのビーカーに沈めます。

次に、パイプ番号 2 のバルブ調整端を真空ラインに接続します。次に、もう一方の端をパイプ番号 3 を使用して窒素ラインに接続します。バルブを開き、手袋が膨らみ、硬すぎて曲げられなくなるまで真空ラインをオンにします。

次に、真空ラインとバルブの両方を閉じます。次に、手袋が収縮して手袋室から伸びるまで窒素ラインを開きます。手袋を着用した後、ハミルトンシリンジを使用して、クロロホルム溶液中の指定された量のDOPCを暗いガラスバイアルに移します。

針が入ったキャップでバイアルを密封します。次に、双方向ジャンクションを使用して、パイプ番号 6 をパイプ番号 8 に、パイプ番号 7 をパイプ番号 9 に接続します。手袋室から手袋を取り外し、出口バルブを開きます。

次に、窒素ラインをゆっくりと開き、ビーカー内の気泡がないかガスの流れを監視します。安定した観察可能なバブリング速度に達するまで、窒素流量を徐々に増やします。3分間流した後、窒素ラインを閉じます。

最後の気泡がビーカーから出たら、出口バルブを閉じます。手袋を元に戻し、パイプ 8 と 9 を双方向ジャンクションから外します。次に、バイアルを開き、キャップを50ミリリットルのチューブに戻します。

次に、オイルボトルを開け、必要な量のオイルを暗いバイアルに移します。バイアルを再びキャップで密封し、手袋を外して、手袋室を開きます。密封された脂質懸濁液バイアルを少なくとも30秒間激しく渦にします。

次に、摂氏80度のウォーターバスで30分間インキュベートします。バイアルを再びボルテックスした後、室温で一晩インキュベートします。はさみを使って、5ミリリットルのチューブからキャップを切り取ります。

キャップの中央に約8mmの穴を開けて、P1000ピペットチップを取り付けます。穴が広すぎて先端に収まらない場合は、キャップを捨てて新しいキャップでやり直してください。2×5センチメートルのサンドペーパーで、ドリル穴の端を滑らかにします。

キャップを5ミリリットルのチューブに戻し、3, 000gで5分間遠心分離して、残留プラスチック粒子を除去します。次に、キャップを外し、チューブを廃棄します。次に、新しい5ミリリットルのチューブからキャップを切り取り、準備した穴の開いたキャップと交換します。

P1000チップを穴に挿入し、チップとキャップの間にOリングをロックして、それ以上の下向きの動きを防ぎます。先端から5.5ミリリットルの外側溶液をチューブに充填します。以前に調製した脂質懸濁バイアルを少なくとも30秒間ボルテックスします。

次に、摂氏50度の水浴で30分間インキュベートします。以前に調製した水溶液を室温で少なくとも10分間平衡化させます。次に、300マイクロリットルの外側溶液を1.5ミリリットルのチューブまたは以前に変更した5ミリリットルのチューブにピペットで入れます。

油溶液の上に100マイクロリットルの脂質懸濁液をゆっくりと層状にし、2つの異なる連続相を確実に形成します。インターフェースを10分間邪魔されずに放置して平衡化します。2 ミリリットルのチューブに、250 マイクロリットルの脂質懸濁液をピペットで入れ、続いて 6.25 マイクロリットルの中液をピペットで入れて、2.5% 油中水エマルジョンを調製します。

エマルジョンが均一で安定しているように見えるまで、2つの相を混合します。調製したエマルジョン200マイクロリットルを、先に形成された油溶液脂質懸濁界面に移します。1.5ミリリットルのチューブを使用する場合は、チューブを閉じるだけです。

変更された5ミリリットルチューブを使用する場合は、ピペットチップにゴム製のキャップを置き、チューブ全体を50ミリリットルの円錐形チューブにそっと移します。チューブを室温で適切な速度で遠心分離します。遠心分離後、底部に不透明なペレットがあり、上部に油相が透明であることを確認します。

GUVの入った5ミリリットルのチューブからオイルを取り除くには、ゴムキャップが所定の位置に留まっていることを確認しながら、ピペットチップをチューブから取り出します。先端を廃棄し、ゴムキャップ、Oリング、ホールドキャップを後で使用できるように保持してください。代わりに、1.5 ミリリットルのチューブを使用する場合は、P1000 マイクロピペットを使用して油溶液を除去し、約 50 マイクロリットルを残し、ペレットを乱さないように注意してください。

ピペットチップを交換し、残りの50マイクロリットルの溶液にペレットを再懸濁します。最後に、再懸濁した材料を清潔な2ミリリットルのチューブに移します。高湿度条件下で調製された脂質溶液は、湿度制御されたチャンバーで調製されたものと比較して、収率が著しく低く、無秩序な凝集体の有病率が高い巨大な単層小胞を生成しましたが、後者にはまだいくつかの凝集体が存在していました。

3, 300gを20分間投与すると、スクロースを充填した小胞の収量と品質は最適でしたが、遠心分離速度が遅いと高い速度の両方で、収量の低下や凝集体の形成などの好ましくない結果が生じました。鉱物油は平均直径分布が大きい小胞を生成し、シリコーンオイルAR 20は全体の小胞数が大幅に増加しました。