ライトシート蛍光顕微鏡を用いた再灌流急性心筋梗塞における心臓損傷と免疫応答の同時3D解析

私たちは、心筋梗塞後の免疫細胞と損傷した組織の相互作用を調べています。免疫応答を理解し、心機能を改善することを目指しています。心筋梗塞後、心筋細胞と細胞、免疫細胞の 3 つの主要な細胞実体すべてを同時にマルチターゲット戦略によって調節する必要があることが提案されました。

心臓の損傷と反応の同時分析に加えて、これまで知られていなかったこれらの損傷領域への3D位置特定を示すことができました。3D 分析は、特にさまざまな標的を多重化する場合、心筋梗塞後の細胞組成を評価するためのより堅牢な方法を提供します。まず、安楽死させたマウスを実体顕微鏡下に置きます。

細いハサミを使用して胸腔を開き、胸郭から首までの血管の出口近くで露出した上大静脈を切開します。ローラーポンプに取り付けられた27ゲージの針を使用して、ヘパリンを含むPBSで左右の心房オラクルを介してその場で心臓を灌流します。心臓の表在血管画の退色や肺や肝臓の白化を観察し、十分な心臓血液の除去を確認します。

鉗子とハサミを使用して、残りの大動脈と周囲の肺組織の少なくとも5ミリメートルとともに心臓を切除し、氷冷のPBSとガーゼをあらかじめ詰めた6センチメートルのペトリ皿に移します。次に、残りの肺、脂肪、血管組織を切り取り、約5ミリメートルの大動脈を持つ心臓だけが残ります。心臓を大動脈カニューレ挿入用に準備された皿に移し、残りの大動脈を20ゲージの鈍い鋼製カニューレの上に引っ張ります。

きれいな5-0縫合糸でカニューレノッチに固定します。再灌流急性心筋梗塞の導入に使用される位置に6-0縫合糸で左前下行動脈を永久に委任します。挿入されたカニューレを介してLexaFluor 546で逆行性に標識された20マイクログラムのマウスNT CD31抗体を含む400マイクロリットルのPBSを注入します。

大動脈からカニューレを慎重に引き抜き、心臓を10ミリリットルの4%パラホルムアルデヒドを含む15ミリリットルのポリプロピレン反応チューブに移します。チューブを暗闇の中で摂氏4度で一晩インキュベートし、攪拌しません。5ミリリットルのポリプロピレン反応チューブ内で撹拌するためにほぼ頭上の回転を使用して、5ミリリットルのPBSを暗闇で室温でそれぞれ10分間3回交換して、固定された心臓を洗浄します。

固定された心臓を脱イオン水中の50%エタノール5ミリリットルで、室温で暗所で少なくとも2時間脱水し、5ミリリットルの反応チューブ内でほぼ頭上回転させて撹拌します。脱水した心臓を漂白するには、10ミリリットルの100%エタノールと5%ジメチルスルホキシド、5%過酸化水素を含む15ミリリットルの反応チューブに移し、暗所で4時間攪拌せずにインキュベートします。漂白した心臓を5ミリリットルの100%エタノールで3回、暗所で室温で12時間洗浄し、5ミリリットルの反応チューブ内でほぼ頭上回転させて攪拌します。

心臓を4ミリリットルの桂皮酸エチルを含む5ミリリットルの反応チューブに移し、暗所で室温で3日間攪拌せずにインキュベートします。透明化したゲルブロックとガムブロックを、顕微鏡サンプルホルダー内で透明化した心臓を安定させるサイズに切断します。画像取得には、作動距離17.6ミリメートルの開口数0.1対物レンズを使用します。

次に、適切な励起フィルターと発光フィルターの設定を使用して蛍光シグナルを検出します。ライトシート顕微鏡イメージングの場合、シート開口数を0.079に選択すると、ライトシートの厚さは5マイクロメートルになります。2つの個別のZ平面間の距離を10マイクロメートルに設定します。

シート幅を100%にして、サンプルの均一な照明を実現します。この図は、マルチチャネル抗体染色と自家蛍光を使用して、危険にさらされている領域、内皮損傷、および浸潤した好中球を局在化する代表的な心臓スライスを示しています。リスクのある領域は、逆行性注射後のCD31染色の欠如、静脈内CD31陰性による内皮損傷、および主に損傷ゾーンの近くにあるLy6G陽性スポットによる好中球の浸潤によって特定されました。

3D レンダリングでは、AAR、内皮損傷、好中球クラスター間の重複が示され、領域特異的な免疫局在が示唆されました。定量化では、AARでは好中球の90.2%であるのに対し、遠隔地では9.8%であり、局所的な炎症を示しています。AAR 内では、好中球の 79.3% が内皮損傷体積の外側にあり、20.7% が内皮損傷体積の内側にあり、損傷の周囲に末梢が集まっていることを示唆しています。