前立腺癌関連線維芽細胞の単離、培養、および特性評価

私たちは、がん関連線維芽細胞が前立腺がんの腫瘍進行に寄与するメカニズムを理解し、治療戦略としてこのクロストークを中和することを目指しています。さまざまな操作で腫瘍細胞および間質細胞を使用して得られた3Dオルガノイドでは、異なる特性を持つCAFの異なる集団を評価することができます。私たちのプロトコルでは、これらの目的のためにCAFを確実に生成できます。

主な課題は、同じ患者の微小環境からの腫瘍細胞と正常細胞の信頼性の高い単離、不均一性、特定の CAF マーカーの欠如、CAF の可塑性、および TME の複雑さを要約する限られた in vitro モデルです。同様の方法で、マウス乳がんCAFにおける転写因子STAT3とその標的遺伝子の基本的な腫瘍促進性の役割を特徴付け、治療標的としての有効性を実証しました。少量の組織を用いて前立腺癌患者から得られた根治的前立腺全摘除術標本の腫ようおよび隣接正常領域からの線維芽細胞の最適分離

まず、線維芽細胞の単離のために、初日に天びんで組織サンプルの重量を量ります。滅菌鉗子を使用して、組織を6センチメートルの皿に移します。4ミリリットルの氷冷PBSで2回、4ミリリットルの氷冷完全DMEMで2回組織を洗浄します。

次に、組織を氷上の6センチメートルのプレートに移します。抗生物質を添加したDMEMを1ミリリットルプレートに加えます。次に、はさみまたは刃を使用して、組織を1平方ミリメートル未満の断片に細かく刻みます。

みじん切りにした組織を、5ミリリットルの氷冷完全DMEMを含む15ミリリットルの円錐形チューブに移します。次に、懸濁液を摂氏4度で5分間754 gで遠心分離します。10ミリリットルのピペットを使用して、上清を取り除きます。

ペレットを5ミリリットルの氷冷完全DMEMに再懸濁し、再度遠心分離します。上清を除去した後、ペレットをコラゲナーゼII溶液に再懸濁します。懸濁液を1.5ミリリットルのマイクロチューブに移します。

マイクロチューブをパラフィンフィルムで密封します。次に、摂氏37度に置いて、8〜12時間連続的に揺らしながら一晩消化します。翌日、消化したサンプルを15ミリリットルの円錐形チューブに移します。

5ミリリットルの氷冷コンプリートDMEMをピペットでピペットでかけ、コラゲナーゼを不活性化します。次に、懸濁液を摂氏4度で5分間754 gで遠心分離します。上清をピペッティングした後、ペレットを1ミリリットルの0.05%トリプシン-EDTAに再懸濁します。

時々振とうしながら摂氏37度で5分間インキュベートします。次に、調製したばかりのDNase I溶液を1ミリリットルのサンプルにピペットで入れ、よく混合します。遠心分離して上清を除去した後、ペレットを5ミリリットルの冷たい完全DMEMに再懸濁し、再度遠心分離します。

得られた細胞を20%ウシ胎児血清を添加した完全なDMEMに再懸濁します。細胞をプレートし、摂氏37度で5%の二酸化炭素と95%の湿度で少なくとも3日間インキュベートします。3日後、細胞の形態と生存率を調べます。

細胞がコンフルエンスに達したら、20%ウシ胎児血清を含む完全なDMEMを含む10センチメートルの皿に細胞を継代します。がん関連線維芽細胞または正常線維芽細胞を12ウェルプレートで70%コンフルエントでプレートします。翌日、無菌条件下で50ミリリットルの円錐形チューブに0.45グラムの低融点寒天培地を12.5ミリリットルのPBSに加えます。

電子レンジを使用して混合物を溶かします。寒天溶液を摂氏37度まで冷却します。次に、予熱した完全DMEMで1対4の比率で希釈して、作業溶液を調製します。

12ウェルプレートから培地を吸引します。500マイクロリットルの作業寒天溶液を各ウェルにピペットで入れます。寒天が固化できるように摂氏4度で20分間インキュベートします。

その間、残りの寒天溶液は摂氏37度に保ちます。腫瘍細胞をトリプシン化し、1ミリリットルあたり20, 000細胞の細胞懸濁液を調製します。等量の腫瘍細胞懸濁液と寒天溶液を混合して、各条件ごとに3回の技術的反復を考慮して、7ミリリットルの最終容量を取得します。

均一な混合を確保するために、複数回上下にピペットをかけます。次に、各ウェルの固化したベース層の上に約5, 000細胞を含むこの混合物の500マイクロリットルを分注する。寒天を摂氏4度で20分間固化させた後、各ウェルに1ミリリットルの完全DMEMを加えます。

ウェルの端からそっと吸引し、中央に新鮮な培地を加えることで、培地を一日おきに交換します。コロニーが見えやすくなるまでインキュベートします。コロニーが見えたら、培地を廃棄します。

次に、200マイクロリットルのニトロブルー塩化テトラゾリウム溶液でコロニーを染色します。加湿インキュベーターで摂氏37度で一晩インキュベートします。翌日、染色液を捨てます。

実体顕微鏡を使用して染色されたコロニーの画像を取得します。純粋な線維芽細胞は首尾よく単離されました。多くの場合、特に初期継代において、がん関連線維芽細胞は、正常な線維芽細胞と比較して、より紡錘体のような形態を示しました。

定量分析により、がん関連線維芽細胞条件培地で処理されたDU145細胞の増殖は、通常の線維芽細胞条件付け培地で処理された細胞または未処理のままにした細胞よりも120時間にわたって有意に高いことが確認されました。がん関連線維芽細胞および正常線維芽細胞と直接共培養されたDU145細胞も、対照と比較して96時間にわたって増殖の増加を示しました。対応する成長曲線は、がん関連線維芽細胞および正常線維芽細胞との共培養が、時間の経過とともにDU145増殖の同様の増加をもたらすことを示しました。

DU145増殖に対するコンディショニング培地の効果は、がん関連線維芽細胞ペアと正常線維芽細胞ペア間で異なり、初期継代ペアは後の継代ペアよりも有意に強い効果を示しました。軟寒天コロニー形成アッセイでは、がん関連線維芽細胞と正常線維芽細胞の両方が対照と比較してDU145コロニーの数とサイズを増加させ、固定非依存性増殖の強化を示しました。技術的な問題により形成された剥離した線維芽細胞層は、一部の反復でコロニー形成を妨げました。

条件付け培地のみでは、DU145細胞における固定非依存性コロニー形成は促進されませんでした。