ロングリードシーケンシング技術を用いたアンプリコンシーケンシング

携帯型ロングリードシーケンシングが、資源制限のある環境で結核耐性感受性の結果をゴールドスタンダード法に匹敵する精度で提供できるかどうかを調査し、アクセスしやすく質の高い結核診断の進展に寄与します。バイオインフォマティクスの専門知識を持たずに臨床サンプルから直接包括的な耐性プロファイルを提供することで、薬剤耐性結核の診断ツールとしてターゲット次世代シーケンシングを活用します。長読みシーケンスを用いた当社のプロトコルは、リアルタイム耐性検出よりも迅速な処理時間とシンプルなワークフローを提供し、包括的な結核診断を促進し、最小限のインフラで資源が限られた環境でのアウトブレイク追跡を強化する可能性があります。

まず、各アンプリコンサンプルの濃度に基づいて100ナノグラムを計算し、必要な体積をクリーンなPCRチューブに移します。試料中のアンプリコンの総質量を求めるには、与えられた式を用います。ヌクレアーゼフリーの水を使って、各サンプルの総体積を12.5マイクロリットルに調整します。

サンプルをピペットで上下に10回優しく混ぜ、マイクロ遠心分離機で短時間回転させます。次に、各サンプルに1.75マイクロリットルのエンド修復およびアデニル化反応バッファーを追加し、続いて0.75マイクロリットルのエンド修復およびアデニル化酵素混合物を加えます。サンプルを混ぜて回転させた後、チューブを25度のサーモサイクラーに30分間、その後65度の温度で30分間浸します。

ネイティブのバーコードライゲーションでは、画面に表示される成分を新しいPCRチューブに追加してください。反応をピペットで優しく混ぜ、マイクロ遠心分離機で短時間回転させます。次に、各チューブに1マイクロリットルのEDTAを加えます。

その後、よく混ぜて先ほどの説明のように短く回します。バーコード化されたサンプルを1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離機チューブに取り込みます。DNAのクリーンアップビーズをボルテックスで完全に再懸浮させ、プールされたサンプル体積の0.7倍の体積を加えます。

ビーズサンプル溶液を混ぜて、室温のHulaMixerで10分間培養します。次に、80%エタノール2ミリリットルを準備し、純粋なエタノール1,600マイクロリットルとヌクレアーゼフリー水400マイクロリットルを混ぜます。チューブを磁気ラックに5分間置き、エリュートが透明で無色になるまで待つ。

その後、ペレットを乱さずに上清液を取り除き捨てます。ビーズを700マイクロリットルの新たに調製した80%エタノールで洗い、チューブを短時間遠心分離します。チューブを磁気ラックに置いた後、残留したエタノールを取り除きます。

次に、磁気ラックからチューブを外してください。ビーズをヌクレアーゼフリーの水35マイクロリットルに優しく弾いて再懸浮させ、37度で10分間培養します。チューブを磁気ラックに戻し、エリュートが透明で無色になるまで続けます。

次に、35マイクロリットルのエリュートを清潔な1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離機管に移し、さらに使用します。アダプターライゲーションでは、与えられた成分を1.5ミリリットルの低結合マイクロ遠心分離機チューブ内で混合します。チューブを短時間遠心分離し、室温で20分間培養します。

DNAのクリーンアップビーズであるボルテックスで、完全に再浮遊します。チューブに20マイクロリットルのビーズを加え、優しく混ぜます。HulaMixerで室温で10分間孵化します。

その後、チューブを磁気式ラックに置き、ビーズをペレットに垂らし、ペレットを乱さずに上清液を吸引します。125マイクロリットルの短い断片バッファーを加え、チューブを優しく弾いてビーズを再び浮かせます。遠心分離機を短くしてチューブを磁気ラックに戻します。

ビーズがペレット化した後、再び上清液を吸引します。次に、チューブを磁気ラックから外し、優しくピペットやはじきで15マイクロリットルの洗脱バッファーにビーズを再懸浮させます。チューブを短時間遠心分離して内容物を採取し、その後37度で10分間培養してDNAを洗出します。

チューブを磁気ラックに置き、エリュートが透明で無色になるまで待つ。次に、15マイクロリットルのエルセットを吸引し、清潔な1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離機チューブに移します。フローセルプライミング溶液を準備するには、与えられた成分を十分に混合します。

フローセルのプライミングポートを開け、約20マイクロリットルのバッファーを吸引して気泡を除去し、気泡を導入せずに800マイクロリットルのプライミングミックスをポートに注入します。DNAライブラリーを準備するには、画面に表示されている成分を十分に混ぜてください。フローセルのサンプルポートキャップを優しく持ち上げ、気泡を発生させずに200マイクロリットルのプライミング混合液をプライミングポートに注入します。

準備済みDNAライブラリーを混合した後、75マイクロリットルのライブラリーをシーケンシングフローセルのサンプルポートにドロップワイドにロードします。フローセルのサンプルポートキャップを閉じ、バングがしっかりサンプルポートに入っているか確認し、プライミングポートをしっかり閉じます。ゲル電気泳動によりほぼすべてのサンプルでアンプリコンの完全性が確認されましたが、サンプル89および136に対応するレーンでは薄いまたは欠如した帯状の帯が見られました。

サンプル89と136はアンプリコン濃度が不足していたため、ロングリードシーケンスから除外されました。すべての標的遺伝子において、長リードおよび短リードプラットフォームは高いカバレッジ深度を達成し、EIS遺伝子が最も高い平均値を示し、RRS遺伝子が最も低いカバレッジ深度を示しました。カバレッジの深さに幅があるにもかかわらず、両プラットフォームはすべての耐性関連遺伝子で99.9%の高いカバレッジ幅を維持しました。

エタンブトール、フルオロキノロン、カナマイシン、アミカシン、カプレオマイシンの薬剤耐性変異は、短リードおよび長リードのシーケンシングプラットフォーム間で100%一致して検出されました。リネゾリド、ベダキリン、クロファジミンのいずれかのシーケンシングアプローチでも耐性関連変異は認められませんでした。ストレプトマイシン耐性検出ではプラットフォーム間の一致度が低く、一致率は71.43%にとどまりました。

主要遺伝子rpoB、katG/fabG1/ahpC/inhA、fabG1/inhA、pncAの検出感度はプラットフォーム間で89.47%から96.77%の範囲でした。