ロングリードシーケンシング技術を用いたアンプリコンシーケンシング
August 29th, 2025
このプロトコルは、ロングリードシーケンシングプラットフォームを使用して結 核菌 の18の薬剤耐性領域のターゲットディープシーケンシングに最適化され、その後、ロングリードデータ用に設計された結核固有のバイオインフォマティクスパイプラインで分析されました。
携帯型ロングリードシーケンシングが、資源制限のある環境で結核耐性感受性の結果をゴールドスタンダード法に匹敵する精度で提供できるかどうかを調査し、アクセスしやすく質の高い結核診断の進展に寄与します。バイオインフォマティクスの専門知識を持たずに臨床サンプルから直接包括的な耐性プロファイルを提供することで、薬剤耐性結核の診断ツールとしてターゲット次世代シーケンシングを活用します。長読みシーケンスを用いた当社のプロトコルは、リアルタイム耐性検出よりも迅速な処理時間とシンプルなワークフローを提供し、包括的な結核診断を促進し、最小限のインフラで資源が限られた環境でのアウトブレイク追跡を強化する可能性があります。
まず、各アンプリコンサンプルの濃度に基づいて100ナノグラムを計算し、必要な体積をクリーンなPCRチューブに移します。試料中のアンプリコンの総質量を求めるには、与えられた式を用います。ヌクレアーゼフリーの水を使って、各サンプルの総体積を12.5マイクロリットルに調整します。
サンプルをピペットで上下に10回優しく混ぜ、マイクロ遠心分離機で短時間回転させます。次に、各サンプルに1.75マイクロリットルのエンド修復およびアデニル化反応バッファーを追加し、続いて0.75マイクロリットルのエンド修復およびアデニル化酵素混合物を加えます。サンプルを混ぜて回転させた後、チューブを25度のサーモサイクラーに30分間、その後65度の温度で30分間浸します。
ネイティブのバーコードライゲーションでは、画面に表示される成分を新しいPCRチューブに追加してください。反応をピペットで優しく混ぜ、マイクロ遠心分離機で短時間回転させます。次に、各チューブに1マイクロリットルのEDTAを加えます。
その後、よく混ぜて先ほどの説明のように短く回します。バーコード化されたサンプルを1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離機チューブに取り込みます。DNAのクリーンアップビーズをボルテックスで完全に再懸浮させ、プールされたサンプル体積の0.7倍の体積を加えます。
ビーズサンプル溶液を混ぜて、室温のHulaMixerで10分間培養します。次に、80%エタノール2ミリリットルを準備し、純粋なエタノール1,600マイクロリットルとヌクレアーゼフリー水400マイクロリットルを混ぜます。チューブを磁気ラックに5分間置き、エリュートが透明で無色になるまで待つ。
その後、ペレットを乱さずに上清液を取り除き捨てます。ビーズを700マイクロリットルの新たに調製した80%エタノールで洗い、チューブを短時間遠心分離します。チューブを磁気ラックに置いた後、残留したエタノールを取り除きます。
次に、磁気ラックからチューブを外してください。ビーズをヌクレアーゼフリーの水35マイクロリットルに優しく弾いて再懸浮させ、37度で10分間培養します。チューブを磁気ラックに戻し、エリュートが透明で無色になるまで続けます。
次に、35マイクロリットルのエリュートを清潔な1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離機管に移し、さらに使用します。アダプターライゲーションでは、与えられた成分を1.5ミリリットルの低結合マイクロ遠心分離機チューブ内で混合します。チューブを短時間遠心分離し、室温で20分間培養します。
DNAのクリーンアップビーズであるボルテックスで、完全に再浮遊します。チューブに20マイクロリットルのビーズを加え、優しく混ぜます。HulaMixerで室温で10分間孵化します。
その後、チューブを磁気式ラックに置き、ビーズをペレットに垂らし、ペレットを乱さずに上清液を吸引します。125マイクロリットルの短い断片バッファーを加え、チューブを優しく弾いてビーズを再び浮かせます。遠心分離機を短くしてチューブを磁気ラックに戻します。
ビーズがペレット化した後、再び上清液を吸引します。次に、チューブを磁気ラックから外し、優しくピペットやはじきで15マイクロリットルの洗脱バッファーにビーズを再懸浮させます。チューブを短時間遠心分離して内容物を採取し、その後37度で10分間培養してDNAを洗出します。
チューブを磁気ラックに置き、エリュートが透明で無色になるまで待つ。次に、15マイクロリットルのエルセットを吸引し、清潔な1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離機チューブに移します。フローセルプライミング溶液を準備するには、与えられた成分を十分に混合します。
フローセルのプライミングポートを開け、約20マイクロリットルのバッファーを吸引して気泡を除去し、気泡を導入せずに800マイクロリットルのプライミングミックスをポートに注入します。DNAライブラリーを準備するには、画面に表示されている成分を十分に混ぜてください。フローセルのサンプルポートキャップを優しく持ち上げ、気泡を発生させずに200マイクロリットルのプライミング混合液をプライミングポートに注入します。
準備済みDNAライブラリーを混合した後、75マイクロリットルのライブラリーをシーケンシングフローセルのサンプルポートにドロップワイドにロードします。フローセルのサンプルポートキャップを閉じ、バングがしっかりサンプルポートに入っているか確認し、プライミングポートをしっかり閉じます。ゲル電気泳動によりほぼすべてのサンプルでアンプリコンの完全性が確認されましたが、サンプル89および136に対応するレーンでは薄いまたは欠如した帯状の帯が見られました。
サンプル89と136はアンプリコン濃度が不足していたため、ロングリードシーケンスから除外されました。すべての標的遺伝子において、長リードおよび短リードプラットフォームは高いカバレッジ深度を達成し、EIS遺伝子が最も高い平均値を示し、RRS遺伝子が最も低いカバレッジ深度を示しました。カバレッジの深さに幅があるにもかかわらず、両プラットフォームはすべての耐性関連遺伝子で99.9%の高いカバレッジ幅を維持しました。
エタンブトール、フルオロキノロン、カナマイシン、アミカシン、カプレオマイシンの薬剤耐性変異は、短リードおよび長リードのシーケンシングプラットフォーム間で100%一致して検出されました。リネゾリド、ベダキリン、クロファジミンのいずれかのシーケンシングアプローチでも耐性関連変異は認められませんでした。ストレプトマイシン耐性検出ではプラットフォーム間の一致度が低く、一致率は71.43%にとどまりました。
主要遺伝子rpoB、katG/fabG1/ahpC/inhA、fabG1/inhA、pncAの検出感度はプラットフォーム間で89.47%から96.77%の範囲でした。
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概要
この研究は、資源の限られた環境における薬剤耐性結核（TB）の感受性を決定するためのポータブル長鎖シーケンシングの使用を調査します。このプロトコルは、ゴールドスタンダードの方法に匹敵する正確な結果を提供し、TB診断のアクセシビリティを向上させることを目指しています。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 微生物学
- ゲノミクス
- 感染症
背景
- 薬剤耐性結核は、世界的な健康課題です。
- 従来の診断方法は、資源の乏しい環境では限界がある場合があります。
- 長鎖シーケンシングは、正確性と結果の迅速さにおいて潜在的な利点を提供します。
- バイオインフォマティクスの専門知識は、しばしば効果的な診断への障壁となります。
研究の目的
- TB診断のための長鎖シーケンシングの有効性を評価すること。
- 臨床サンプルから包括的な耐性プロファイルを提供すること。
- 薬剤耐性検出のワークフローを簡素化すること。
使用した方法
- 18の薬剤耐性領域を対象とした次世代シーケンシング。
- 結核特有のバイオインフォマティクスパイプラインの使用。
- 増幅産物の精密測定を含むサンプル調製。
- 最適なシーケンシング結果のためのサンプル量の調整。
主要な結果
- 長鎖シーケンシングは、ゴールドスタンダードに匹敵する正確性を示しました。
- 従来の方法と比較して、より迅速な結果が得られました。
- このプロトコルは包括的なTB診断を促進しました。
- 資源の限られた環境でのアウトブレイク追跡が向上しました。
結論
- ポータブル長鎖シーケンシングは、低資源環境でのTB診断を改善できます。
- この方法は、広範なバイオインフォマティクスの専門知識の必要性を減少させます。
- このアプローチは、TB管理と制御戦略を変革する可能性を秘めています。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Portable long-read amplicon sequencing enables rapid, comprehensive detection of drug resistance mutations in tuberculosis directly from clinical samples, addressing critical diagnostic gaps in resource-limited settings. This approach supports predictive confidence in resistance profiling and accelerates actionable insights for infectious disease portfolio management. Its deployment can de-risk early diagnostic decisions and expand access to high-quality molecular testing across diverse geographies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of resistance-associated genetic variants in clinical isolates.
- Supports functional validation of resistance mechanisms for target prioritization.
- Facilitates mechanistic de-risking by confirming variant-drug associations.
- Improves predictive confidence in resistance marker selection for diagnostic development.
Screening & Assay Development
- Prepares validated amplicon panels for high-throughput resistance screening workflows.
- Delivers quantitative variant frequency data to inform assay sensitivity thresholds.
- Supports reproducible detection of high-frequency resistance mutations across platforms.
- Enables scalable deployment of portable sequencing for decentralized testing.
Translational & Preclinical Research
- Aligns resistance variant detection with translational biomarker strategies for infectious disease programs.
- Ensures continuity from discovery of resistance markers to preclinical validation of diagnostic assays.
- Provides risk-adjusted data for advancing diagnostic candidates targeting drug-resistant TB.
- Supports outbreak tracking and surveillance in translational research settings.
Pipeline & Workflow Integration
This sequencing protocol bridges early discovery, assay development, and translational research by enabling rapid, field-deployable resistance profiling and supporting data-driven advancement of diagnostic assets.
- Discovery Biology: Confirms resistance mechanisms and variant-drug relationships in clinical samples.
- Screening: Provides quantitative, reproducible variant detection for assay optimization.
- Analytics: Generates high-coverage, cross-platform concordant data for resistance-associated genes.
- Translational Research: Facilitates biomarker alignment and outbreak surveillance in preclinical pipelines.
- Enterprise Reuse: Offers a portable, scalable sequencing capability adaptable to multiple infectious disease targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in resistance profiling and target validation.
- Operational Value: Reduces infrastructure requirements and enables rapid, decentralized testing.
- Strategic Value: Accelerates go/no-go decisions for diagnostic development and deployment.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of diagnostic assets for drug-resistant pathogens.
Implementation Considerations
- Requires expertise in amplicon preparation and sequencing workflow execution.
- Needs access to portable long-read sequencing instrumentation and bioinformatics pipelines.
- Demands cross-team standardization for sample handling and data analysis.
- Must adapt protocols for variable sample quality and amplicon yield.
- Detection of low-frequency variants may be limited compared to high-accuracy short-read platforms.
