細胞分解能によるホールマウントRetinal Organoidの可視化

私たちの研究は、ヒト網膜がどのように形成され、病気がどのように影響し、どのように治療できるかを研究するために、ヒトのin vitroモデルとして機能する網膜オルガノイドの開発と研究に焦点を当てています。

再生医療分野の研究を進めるため、3次元網膜オルガノイドと光学透明化・免疫標識を組み合わせて構造全体を可視化し、共焦点顕微鏡で網膜細胞の特殊な組織を研究しています。

ホールマウントイメージングは、緻密組織への抗体の不均一な浸透やオルガノイドの球面収差などの課題に直面しており、組織の視覚化中に表面バイアス標識や焦点喪失を引き起こします。

私たちの方法は、網膜細胞の接続、細胞の種類を 3D 組織下で明らかにし、網膜疾患の根本的な原因についての重要な洞察を提供します。

[講師]まず、無水DMSOに溶解し、脱水して凍結した蛍光色素アリコートを入手します。1〜10マイクロリットルのDMSOをアリコートに加えます。次に、50マイクロリットルの二次免疫グロブリンGまたは一次抗体、6マイクロリットルの1モル重炭酸ナトリウム、および1〜5マイクロリットルの蛍光色素を組み合わせ、光から保護した室温でロッキングプラットフォーム上で40分間インキュベートします。反応が進行している間に、精製サイズ除外カラムの蓋を外し、バッファーを通過させます。2〜3ミリリットルのPBSをカラムに3ラウンド通して、カラムを平衡化します。インキュベーションが終了する前に最後の平衡化が終了した場合は、蓋が引っ張らないように蓋を元に戻し、反応が完了するのを待ちます。インキュベーション後、標識反応に140マイクロリットルのPBSを加えて、体積を約200マイクロリットルにし、ボルテックスします。溶液を列の中央に追加し、列に入れます。最後の一滴が逃れたら、550マイクロリットルのPBSで溶液を押し出します。液体の落下が止まったら、300マイクロリットルのPBSで溶出し、1.5ミリリットルの微量遠心チューブに集めます。280ナノメートルでサンプルの吸光度を測定し、蛍光色素特異的波長で抗体濃度と標識比を計算します。標識抗体は、光から保護された摂氏4度で最大6か月間保管します。網膜オルガノイドを室温で4%パラホルムアルデヒドで45分間固定します。固定後、オルガノイド上に抗原回収溶液を加え、摂氏60度で、毎分30回転で軽く振とうしながら1時間インキュベートします。次に、オルガノイドを1%Triton X-100を含むPBSで透過処理します。混合物を室温で4時間軽く振とうしながらインキュベートします。次に、0.1%Triton X-100で2%BSAのオルガノイドを室温で一晩または1日以上ブロックします。翌日、希釈した一次抗体をオルガノイドに加えます。摂氏4度で2日間、軽く振とうしながらインキュベートします。オルガノイドを室温の洗浄液でそれぞれ15分間、軽く振とうしながら3回洗浄します。次に、希釈液の二次抗体を加え、穏やかに振とうしながら摂氏4度で2日間インキュベートします。先に示したようにオルガノイドを洗浄した後、オルガノイドを室温で洗浄液で希釈した蛍光色素と軽く振とうしながら1時間インキュベートします。その後、もう一度洗います。次に、15%、30%、45%、60%、75%、および90%の濃度の超純水中で1-プロパノール溶液を調製し、トリメチルアミンでそれぞれpH 9.5に調整します。1-プロパノール溶液の勾配を増加させ、摂氏30度でそれぞれ2時間、軽く振とうしながらサンプルを順次脱水します。次に、サンプルを100%1-プロパノール溶液に移し、穏やかに振とうしながら摂氏30度で一晩インキュベートします。サンプルの透明化のために、ベンジルアルコールと安息香酸ベンジル混合物を1対2の比率で調製して、BABB溶液を作ります。サンプルを室温でBABBに一晩浸漬します。イメージングする前にBABBソリューションを更新します。ガラスピペットを使用して、オルガノイドをBABBを一滴垂らしたガラス底のペトリ皿に置き、カバーガラスの表面に接触するようにします。次に、低倍率および高倍率の対物レンズを備えた倒立共焦点レーザー走査顕微鏡を使用して、3Dセル解像度のZスタック画像を取得します。透明化溶液と浸漬媒体の間の屈折率の不一致を考慮して、Zスタック取得のステップサイズを再校正します。次に、ImageJを起動し、[画像]を選択して[プロパティ]をクリックしてボクセル深度を更新し、Zスタックの画像投影を作成します。画像、スタック、直交ビューを選択して、網膜オルガノイドのXY、XZ、およびYZビューを表示することで、Zスタックの深さを調べます。[ファイル] をクリックし、[名前を付けて保存] を選択して、目的の領域を保存します。 最後に、処理ソフトウェアを使用して Z スタックの 3D レンダリングのアニメーションを作成します。フルクトースグリセロールで除去された網膜オルガノイドは、透明性の改善が最も少なく、オルガノイドコアの視覚化を妨げました。ECIクリアリングにより、網膜層の可視化が改善されましたが、持続的な光散乱によりオルガノイドコアを明らかにすることができませんでした。蛍光透明BABB透明オルガノイドは最高の透明性を示し、一貫した蛍光で皮質とコアの両方を明確に明らかにしました。ECIと蛍光BABBでクリアされたオルガノイドはどちらも、脱水ステップにより明視野画像で目に見える収縮を示しました。BABBによる収縮により、サンプルのコンパクトさが向上し、高倍率の対物レンズを使用してより深い構造を画像化できるようになりました。in vitroでの40日目のTUJ1免疫標識は、目に見える層別化のない単一の薄いニューロン層を示しました。90日までに、細胞は頂端領域に密に分布し、170日で、オルガノイドは定義された頂端ゾーンを持つ層状組織の明確な兆候を示しました。200日で、細長い細胞突起が表面からコアに内側に伸び、オルガノイドは250日で3つの異なる網膜層に発達しました。神経線維は、成熟を越えてオルガノイド中心から末梢に向かって伸び、in vitroで250日までに太く複雑になります。青と緑/赤のオプシンを発現する錐体光受容体は後期に現れ、先端が明るい細長い形態を示しました。ロドプシンを発現する桿体光受容体は、その中心核と末梢オプシンの分布によって同定されました。Chx10陽性細胞は当初広く分布していましたが、後にオルガノイド成熟中に内核層に特異的に局在しました。内因性GCaMP6s発現はBABBクリアリング後も維持され、長期固定後に神経網膜でGFPシグナルが検出可能でした。