Name: 細胞分解能によるホールマウントRetinal Organoidの可視化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-20T13:35:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: 学ぶ 光学クリアリングと免疫標識を組み合わせたホールマウント網膜オルガノイドの可視化法。3D構造の保存と共焦点顕微鏡による神経細胞層の詳細観察が可能になり、網膜の成熟と疾患モデリングの理解に貢献します。

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1. カスタムメイドの蛍光二次抗体の調製
注:このアプローチは、市販の蛍光抗体の使用に代わるものとして機能します(蛍光二次抗体を調製する利点については、ディスカッションを参照してください)。さらに、このプロトコールは、直接免疫蛍光法を行う必要があり、蛍光一次抗体が市販されていない場合に、蛍光色素を一次抗体に結合するために使用できます。標識反応中の蛍光色素の量を調整して蛍光色素分子と抗体の比率を制御すると、より明るい標識抗体が生成されます。しかし、カスタムメイドの二次抗体は安定性が低く、得られるコンジュゲートの濃度は市販の蛍光抗体の濃度よりも10倍低くなっています。このプロトコルは、Bálint et al9によって記述された研究から採用されています。
<ol>
	<li>1 mgの蛍光色素を無水DMSOに溶解し、チューブに分注して、チューブあたり最終的に0.02 mgの蛍光色素を調製します。速度真空濃縮器を使用して、1時間30分間運転して、すべてのDMSOを取り外してください。アリコートは-20°Cで保管し、光から保護してください。Alexa Fluor 405の場合、超高純度のH2Oはアリコートの作製に適した溶媒です。</li>
	<li>標識反応を行うには、蛍光色素の1アリコートを1〜10 μLのDMSO(またはAlexa Fluor 405の場合は超高純度H2O)に溶解します。 注:DMSOの正確な量は、以前の制御標識試験によって決定されます。これらの試験は、蛍光色素の新しいバッチを使用するとき(または以前の蛍光色素のバッチがなくなるとき)、または新しい蛍光色素が初めて標識で使用されるときに実行されます。コントロール標識試験では、さまざまな量の蛍光色素で標識反応を行い、標識中の最適な蛍光色素分子と抗体の比率を決定します。私たちの場合、最適な比率は通常、3μLから5μLの間にあります。</li>
	<li>50 μLの二次IgG(または一次)、6 μLの1 M NaHCO3、および1-5 μLの蛍光色素を、光から保護されたロッキングプラットフォーム上で室温(RT)で40分間インキュベートします。</li>
	<li>反応が進行している間に、精製サイズ排除カラムの蓋を外してバッファーを通過させて調製します。カラム(標識反応ごとに1つ)を3 x 2-3 mLのPBSをカラムに通して平衡化します。インキュベーションが終了する前に最後の平衡化ステップが終了した場合は、蓋が乾かないように蓋を戻し、標識反応が終了するまで待ちます。 注:精製サイズ除外カラムは重力によって機能します。カラムが乾かないように注意してください、さもなければ精製反応は適切に機能しません。</li>
	<li>反応が終了したら(ステップ1.3)、標識反応に140μLのPBSを加えて容量を約200μLにし、ボルテックスします。この溶液をカラムの中央に加え、サンプルをカラムに注入し、最後の一滴が溶出した後、550 μLのPBSを加えて押し込みます。液の落下が止まったら、PBSを300 μL加えて溶出し、1.5 mLの微量遠心チューブに回収します。</li>
	<li>280 nmでのサンプルの吸光度と使用した蛍光色素の吸光度を測定することにより、抗体濃度と標識比を計算します。ランベルトベールの法則を適用して、次のように濃度(モル濃度)を決定します。 
	<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/68384/68384eq1.jpg" style="opacity: 0.9;"> ここで、Aは吸光度、εはモル吸光係数、CF280 は特定の蛍光色素が280nmで持つ吸光度の測定値であり、補正係数として機能します。次に、抗体の濃度は次のようになります。 
	<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/68384/68384eq2.jpg" style="opacity: 0.9;"> また、ラベルの比率は次のとおりです。 
	<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/68384/68384eq3.jpg"></li>
	<li>標識した抗体は、光から保護した4°Cで最大6ヶ月間保存してください。</li>
</ol>
2. 免疫蛍光標識
<ol>
	<li>オルガノイドを4%パラホルムアルデヒド(PFA)で室温で45分間固定します。 注:オプション:オルガノイドを抗原賦活化溶液(ステップ2.2および2.3)とインキュベートして、抗原の免疫反応性を高めます。</li>
	<li>0.117 mgのクエン酸ナトリウム三塩基性二水和物を超高純度H2Oに混合して40 mLの抗原賦活化溶液を調製し、pH 9に調整します。</li>
	<li>オルガノイドを抗原賦活化溶液と軽度振とう(30 rpm)し、60°Cで1時間インキュベートします。</li>
	<li>オルガノイドをPBST(PBS、1%Triton X-100を含む)で透過処理し、RTで4時間軽度に振とうします。</li>
	<li>オルガノイドをブロッキング溶液(2%ウシ血清アルブミン(BSA)と0.1%トリトンX-100)で室温で一晩(または1日以上)ブロックします。 注:一次抗体と二次抗体の濃度は、特定の抗体によって異なります。ホールマウントサンプルの免疫蛍光染色には、切片サンプルと比較して高濃度を使用します。一次抗体を10 μg/mLでインキュベートしますが、これはほとんどの場合、ストックから1:100に相当します(表1)。カスタムメイドの二次抗体を20-50 μg/mLでインキュベートします。</li>
	<li>オルガノイドを洗浄液(0.1% BSAと0.1% Triton X-100)で希釈した一次抗体とオルガノイドを4°Cで2日間、軽度の振とうでインキュベートします。</li>
	<li>オルガノイドを洗浄液で15分間3回、室温で軽く振とうしながら洗浄します。</li>
	<li>オルガノイドを、4°Cの洗浄液で希釈した二次抗体とオルガノイドを2日間、軽く振とうしながらインキュベートします。</li>
	<li>オルガノイドを洗浄液で15分間3回、室温で軽く振とうしながら洗浄します。 注:免疫標識後、選択した蛍光色素をインキュベートできます。通常、アクチンフィラメント網の可視化には、DAPI(1:1,000)やDRAQ5(1:500)などの蛍光核マーカーや、ファロイジン(1:100)を使用します。</li>
	<li>オルガノイドを、室温洗浄液で希釈した蛍光色素とオルガノイドを1時間インキュベートし、軽度の振とうを行います。</li>
	<li>オルガノイドを洗浄液で15分間3回、室温で軽く振とうしながら洗浄します。</li>
</ol>
3. FluoClear BABBによる光学クリアリング
注:1-プロパノールは、特に長期間の暴露により、プラスチック容器を損なう可能性があります。安全のため、ガラス容器を使用してください。
<ol>
	<li>脱水ステップ<ol>
		<li>超高純度H2O中の1-プロパノール溶液を所定の割合(15%、30%、45%、60%、75%、90%)で調製し、トリメチルアミンでpH 9.5に調整します。 注意:トリエチルアミンは吸入すると有毒です。ヒュームフードの下で作業します。溶液は、適切に保管すれば再利用できます(密閉容器)。使用前にpHを調整してください。</li>
		<li>1-プロパノール溶液(15%、30%、45%、60%、75%、90%)のグラジエントを増やしながら、30°Cでそれぞれ2時間、穏やかな振とうをしながらサンプルをインキュベートします。</li>
		<li>サンプルを100% 1-プロパノールと100%プロパノールと共溶かし、30°Cで一晩インキュベートします。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>クリアステップ 注意: BABBは、多くのプラスチックを溶解または大幅に損傷する能力で知られる強力な溶剤混合物です。安全のため、互換性のある蓋付きのガラス容器を使用し、ドラフト内で作業してください。<ol>
		<li>ベンジルアルコール(BA)と安息香酸ベンジル(BB)を1:2の比率で混合して、BABBを調製します。</li>
		<li>サンプルをRTのBABBに一晩浸漬します。</li>
		<li>イメージングする前に、TABBをリフレッシュしてください。 注:直径~1 mmのオルガノイドの場合、BABBは数十分で明らかな透明化効果を誘発します。サンプルのサイズと性質に応じて、透明化の程度が異なる場合や、透明化溶液への曝露時間が長くなる可能性があります。クリアリングプロトコルを改善するために、BABBイマージョンの前後に画像を取得することをお勧めします。</li>
		<li>BABBクリアサンプルは、BABB溶液で4°Cで長期間保存してください。 蛍光を保つために光から保護してください。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. ホールマウント画像取得
<ol>
	<li>ガラスピペットを使用して、オルガノイドをガラス底のペトリ皿に置き、BABBを一滴垂らします。サンプルがカバーガラスの表面に接触していることを確認してください。 注意: サンプルを含むBABBの滴が皿のプラスチックの端に接触しないように注意してください、またはプラスチックを溶かしてサンプルとイメージングの品質を損ないます。</li>
	<li>低倍率と高倍率の対物レンズを備えた倒立共焦点レーザー走査型顕微鏡を使用して、Zスタック画像を取得し、細胞の詳細を含むサンプルの完全な3D洞察を取得します。 注:この研究では、10倍開口(NA)0.4エア対物レンズと63倍NA1.4対物レンズを使用し、ステップサイズはそれぞれ3.5μmと1μmでした。</li>
</ol>
5. 画像処理
<ol>
	<li>クリアリング溶液と液浸媒体との間の屈折率(RI)の不一致を考慮して、Zスタック取得のステップサイズを再校正します。<ol>
		<li>再キャリブレーションされたステップ サイズを次のように計算します。 
		<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/68384/68384eq4.jpg"> BABBに埋め込まれたサンプルを、3.5 μmステップサイズのエア対物レンズでイメージングすると、次のようになります。 
		<img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/68384/68384eq5.jpg" style="opacity: 0.9;"></li>
		<li>ImageJ を使用して、 ボクセルの深度 を変更します ( [Image |プロパティ...)(再計算されたステップ サイズ)。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Z スタックの画像投影を作成します。<ol>
		<li>ImageJ を使用して、Z スタックを詳細に調べます ( [Image |スタック |直交ビュー)。網膜オルガノイドのXY、XZ、およびYZビューが表示されます。</li>
		<li>目的の関心領域を保存します( [ファイル]|名前を付けて保存...)。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>処理ソフトウェアを使用して、Zスタックの3Dレンダリングのアニメーションを作成します( マテリアルの表を参照)。<ol>
		<li>視覚化するチャネルを選択するには、そのチェックボックスを有効にします。</li>
		<li>Z平面を調整して、サンプルの内部を視覚化します(チェックボックスの クリッピング を有効にします)。</li>
		<li>ムービーエディタを使用してアニメーションを録画します(チェックボックスでムービーエディタを有効にします)。ドラッグアンドドロップし、マウスを使用して直接ズームインおよびズームアウトします。[追加] をクリックして、アニメーションに別のクリップを含めます。Z平面を調整する場合は、クリップ平面オプションを有効にします([設定]をクリックします...|[クリップ平面]ボックスをオンにします)。 </li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Lee, Y. J., Jo, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+organoids+from+induced+pluripotent+stem+cells+of+patients+with+inherited+retinal+diseases%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev+Rep%22%5BJournal%5D)">Retinal organoids from induced pluripotent stem cells of patients with inherited retinal diseases: A systematic review.</a> Stem Cell Rev Rep. 21 (1), 167-197 (2025).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>10x NA0.40 DRY 対物レンズ</td><td>ライカ</td><td>HC PL APO CS2</td><td>-</td></tr><tr><td>63x NA1.40 OIL対物レンズ</td><td>ライカ</td><td>HC PL APO CS2</td><td>-</td></tr><tr><td>抗GFP抗体</td><td>アブカム</td><td>アブ13970</td><td>-</td></tr><tr><td>ベンジルアルコール(BA)</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>13162</td><td>-</td></tr><tr><td>安息香酸ベンジル(BB)</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>W213802</td><td>-</td></tr><tr><td>底ガラスシャーレ</td><td>マットテック</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>-</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン(BSA)</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>A7030</td><td>-</td></tr><tr><td>Chx10抗体</td><td>スタ・クルス・バイオテック</td><td>SC-365519</td><td>-</td></tr><tr><td>Cytiva Illustra Nap-5 ゲルろ過カラム、Sephadex G-25</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>17-0853-02</td><td>-</td></tr><tr><td>DAPIの</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>D9542</td><td>-</td></tr><tr><td>DMSOの</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>D8418</td><td>-</td></tr><tr><td>ドラキュ5</td><td>サーモフィッシャー</td><td>62251</td><td>-</td></tr><tr><td>染料(カルボン酸、スクシンイミジルエステル)</td><td>Invitrogen または Abberior</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>ImageJ/フィジー&nbsp;</td><td>NIHの</td><td>&nbsp;v1.50i</td><td>-</td></tr><tr><td>倒立共焦点レーザー走査顕微鏡</td><td>ライカマイクロシステム</td><td>TCS SP8 ステッド 3X-ファルコン</td><td>-</td></tr><tr><td>LAS X 3D処理ソフトウェア</td><td>ライカマイクロシステム</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>mQ H2O</td><td>-</td><td>-</td><td>Synergy浄水システムによる超純水</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>アクロスオーガニック</td><td>424270010</td><td>-</td></tr><tr><td>非標識二次IgG</td><td>ジャクソン免疫研究</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>オプシンブルー抗体</td><td>ミリポア&nbsp;&nbsp;</td><td>AB5407&nbsp;</td><td>-</td></tr><tr><td>オプシンRG抗体</td><td>ミリポール</td><td>AB5745&nbsp;</td><td>-</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド(PFA)4%</td><td>サーモサイエンティフィック&nbsp;</td><td>J199943-K2</td><td>-</td></tr><tr><td>PBSソリューション</td><td>ギブコ</td><td>18912-014</td><td>-</td></tr><tr><td>ファロイジン標識プローブ</td><td>サーモフィッシャー</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水(PBS)</td><td>ギブコ&nbsp;</td><td>10010023</td><td>-</td></tr><tr><td>RECOV抗体</td><td>ミリポール</td><td>AB5585-I&nbsp;</td><td>-</td></tr><tr><td>RHO(RET-P1)抗体</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>O4886&nbsp;</td><td>-</td></tr><tr><td>クエン酸ナトリウム三塩基性二水和物&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>C8532</td><td>-</td></tr><tr><td>トリトンX-100</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>T8787</td><td>-</td></tr><tr><td>TUJ1抗体</td><td>コーバンス&nbsp;</td><td>MMS-435P&nbsp;</td><td>-</td></tr></tbody></table>

細胞分解能によるホールマウントretinal organoidの可視化

Whole-mount Retinal Organoid Visualization with Cellular Resolution

細胞分解能によるホールマウントRetinal Organoidの可視化

Retinal organoids derived from human induced pluripotent stem cells are intricate 3D structures that mimic the human retina, offering a powerful platform ...

whole-mount-retinal-organoid-visualization-with-cellular-resolution

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

オルガノイドの全体の3D構造および細胞内容、ならびに元の組織に似たその表現型は、ここで説明する単一細胞分解能3D画像化プロトコルを使用して捕捉することができる。このプロトコルは、起源、大きさおよび形状が変化するオルガノイドの広い範囲に適用することができる。...

インタクトオルガノイドの単一細胞分解能3次元イメージング

ヒト多能性幹細胞(hPSC)由来の網膜組織を大型動物モデルの網膜下腔に移植する手術手技について紹介する。...

ネコ大型動物モデルにおけるヒト胚性幹細胞由来網膜組織の網膜下移植

本研究は、外植物の取り扱い中にレチナル完全性を損なうことを防ぐ新しいヒトの妄想性レチナルカルチャー(HORC)モデルの開発を目的としている。これは、上層の色素および下層の網膜色素上皮-脈絡膜(RPE-脈絡膜)および皮膜で網膜を培養することによって達成される。...

新しいヒトの言語性の高いレティナル文化技術の特徴付け

自己組織化法を用いて、光受容体の生成を大幅に増加させる可能性のあるCOCOを添加したプロトコルを開発します。...

ヒト多能性幹細胞からの網膜オルガノイドの誘導

ここでは、ヒトの多能性幹細胞株が再現性と効率の高い人工組織を生成するのに適した最適化されたレチナルオルガノイド誘導システムについて説明します。...

ヒト多能性幹細胞からの3Dレチナル組織の導出のためのレチナルオガノイド誘導システム

このプロトコルは、接着培養システムと浮遊培養システムの両方を含む簡略化された培養条件を使用して、hiPS細胞を眼野クラスターに分化させ、神経網膜オルガノイドを生成する効率的な方法について説明しています。RPEや角膜上皮などの他の眼細胞タイプも、網膜培養の成熟眼野から単離することができます。...

健常および網膜疾患特異的ヒト誘起多能性幹細胞からの網膜オルガノイドの作製

このプロトコールは、透過型電子顕微鏡用のレチナールオルガノイドサンプルの最適化された精巧な調製手順を提供します。成熟した網膜オルガノイドのシナプス分析を含むアプリケーションに適しています。...

透過型電子顕微鏡法のためのレチナールオルガノイドサンプルの調製

ミクログリアは、網膜に特異的に存在した免疫細胞であり、さまざまな網膜変性疾患において重要な役割を果たしています。網膜オルガノイドとミクログリアの共培養モデルを作成することで、網膜疾患の病因と発症の進行の理解を深めることができます。...

ミクログリアによる網膜オルガノイドの組み立て

蛍光トマトレクチンの眼窩後注射後、血小板由来成長因子受容体βによる免疫蛍光染色により、網膜血管系の周皮細胞を調べました。標識された網膜をさらに組織透明化法で処理し、共焦点顕微鏡下で網膜血管系を取り巻く周皮細胞の3次元ビューを視覚化するために全体をマウントしました。...

免疫染色によるマウス網膜血管周皮細胞の3D可視化 

網膜は、その層状構造全体で複雑な空間構成を示します。最新の空間トランスクリプトミクスおよびシーケンシング技術では、厚さ20μm&lt;組織切片が必要であり、網膜研究の適用性は限られています。この新鮮凍結凍結切片法は、平面的な空間的関係を維持しながら、マウス網膜の薄い 顔...

顔面 高次元空間分子解析のためのマウス網膜の凍結切片

学ぶ 光学クリアリングと免疫標識を組み合わせたホールマウント網膜オルガノイドの可視化法。3D構造の保存と共焦点顕微鏡による神経細胞層の詳細観察が可能になり、網膜の成熟と疾患モデリングの理解に貢献します。

細胞分解能によるホールマウントRetinal Organoidの可視化

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