マウスバレル皮質における概日シナプス可塑性の解析のための可視化技術としての透過型電子顕微鏡

神経可塑性、特にシナプス、ニューロン、グリア細胞の可塑性の概日変化に関心があります。私たちは、昼夜、そして病理学的条件下でシナプスがどのように変化するかという質問に答えようとしています。私たちの研究分野での最新の開発は、さまざまな遺伝的ツールを使用して遺伝子発現を操作することであり、脳の変化を視覚化する方法も使用しており、神経変性疾患を研究するための動物モデルの数も増えています。電子透過顕微鏡を用いて、マウスの樽皮質のシナプスの数が昼夜で変化することを発見しました。そして、このリズムは、少なくとも抑制性シナプスの場合には概日リズムでもあります。抑制性シナプスであるため、夜間は数が増加し、興奮性シナプスは日中に増加します。ショウジョウバエの脳にも同様の変化が見つかりました。この種では、シナプスの数も昼夜に変化します。また、ニューロンやグリア細胞の形状に構造変化が見られました。

[ナレーター]まず、マウスの小脳を取り、脳を2つの半球に分けます。1つの半球を選択し、セクションがバレル皮質に接線方向に切断できるように向きを変えます。次に、切片を厚さ60マイクロメートルで切断し、0.1モルのリン酸緩衝液と固定液を含む溶液に1対5の比率で移します。光学顕微鏡で切片を調べ、樽場皮質をはっきりと示している切片のみを収集します。絵筆を使用して、セクションを小さなガラスのペトリ皿にそっと移します。脳切片を0.1モルカコジレートですすぎます。次に、1.5%フェリシアン化カリウムを含む0.1モルカコジレート緩衝液中の1%四酸化オスミウムに切片を固定します。切片を蒸留水ですすぎたら、25 mm フィルター付きのシリンジを使用して、1% 酢酸ウラニルを含む 70% エタノールを組織の入った各ペトリ皿にゆっくりと分注します。摂氏4度の70%エタノールで一晩インキュベートした後、組織を80%、90%、および100%エタノールで洗浄します。次に、組織をプロピレンオキシドでそれぞれ10分間2回洗浄します。次に、プロピレンオキシドを 2 ミリリットルのポリ/ベッド樹脂とプロピレンオキシドの 1 対 1 の混合物に置き換えます。蓋をして40分間インキュベートします。脳切片をポリ/ベッド樹脂とプロピレンオキシドの3対1の混合物の2ミリリットルに埋め込みます。蓋をして1.5時間放置します。次に、ACLARフィルムを標準的なスライドガラスのサイズに一致する小片にカットします。プラスチックピペットを使用して、各ACLARフィルム片に少量の樹脂を塗布します。絵筆で、脳切片をペトリ皿からACLARフィルム上の樹脂に転写します。各セクションを2つのACLARフィルムの間に埋め込み、インキュベートして重合させます。2倍対物レンズの光学顕微鏡を使用して、埋め込まれた脳の切片を撮影します。画像を開くには、[ファイル] をクリックして [開く] をクリックし、Shift キーを押しながら画像を選択して、[開く] をクリックします。皮質から画像の積み重ねを開始します。各画像のレイヤー1を右クリックし、レイヤーの複製を選択し、ダイアログボックスに画像番号を名前として入力します。保存先ファイルとして画像を 1 つ選択し、[OK] をクリックします。次に、移動ツールを使用して画像を手動で位置合わせし、必要に応じて編集、変換、回転、または反転で方向を調整します。より細かい調整を行うには、編集、変形、歪み、角を個別に移動して、解剖学的ランドマークに合わせます。最上位レイヤーの描画モードをレイヤーパネルでオーバーレイするように設定して、配置を容易にします。バレル皮質を表示する各セクションで、実体顕微鏡を使用して選択したバレルを特定し、カミソリの刃を使用して隣接するバレルと一緒に切り取ります。断面を樹脂ブロックに埋め込んだ後、超薄型断面をFormvarコーティングされたシングルスロットニッケルグリッドに集めます。前に示したようにTEM画像スタックを整列させた後、分析領域を定義します。[レイヤー]をクリックし、[新規]と[レイヤー]の順にクリックし、[OK]をクリックします。[長方形]ツールを選択し、[レイヤー]、[レイヤースタイル]、[ストローク]に移動します。線の色、太さ、位置を内側に設定し、[OK]をクリックします。次に、四角形を描画して解析境界を定義し、[0% を塗りつぶす]を選択します。注釈用の新しいレイヤーを追加するには、「レイヤー」、「新規」、「レイヤー」を選択し、「OK」をクリックします。ブラシツールを使用して、このレイヤーのシナプスにマークを付けます。ズームツールとハンドツールを使用して、注釈を付ける際の精度を確保します。次に、3D 再構成を目的とした画像スタックを開きます。切り抜きツールを選択し、スタック全体に樹状突起の背骨を含む領域に印を付けて、Enter キーを押して、表示されているすべてのレイヤーでその領域を切り抜きます。一度に 1 つのレイヤーのみを表示するには、レイヤーパネルで目のアイコンを切り替えます。[ファイル]、[名前を付けて保存]、ファイルに名前を付け、JPG形式を選択し、[OK]をクリックして、トリミングした各画像を個別に保存します。3D再構成ソフトウェアを開きます。アップロードする前に、ナビゲーション ギズモの Z をクリックするか、テンキー 7 を押してビューポートのパースペクティブを揃えます。次に、画像をアップロードするには、[追加]、[画像]、[参照] の順にクリックし、最初の画像を選択してダブルクリックして確認します。 最終的なTEM画像をZ軸に沿って配置するには、画像をクリックします。右側のサイドバーの [オブジェクトのプロパティ] パネルで、[場所の Z] フィールドに適切な値を入力します。すべてのイメージを Z 軸に沿って均等に配置するには、すべてのイメージオブジェクトを選択します。[終了]を押して、[終了]パネルを開きます。[編集]タブに移動し、[Z を分布]をクリックして、断面の厚さに基づいて自動的に間隔を空けます。画像ごとに1つの曲線を使用して、各TEM画像の樹状突起棘の形状の輪郭を手動で描くには、[追加]、[曲線]、および[円]をクリックします。円を移動するには、g キーを押しながらマウスをドラッグし、クリックして配置を確認します。を押したままサイズを調整し、クリックして確定します。次に、樹状突起の脊椎の形状に合わせてオブジェクトを拡大縮小します。次に、背骨の境界に合わせて曲線形状を修正します。コントロールポイントを選択し、gを押してポイントを移動し、クリックして確定します。必要に応じて g キーまたは s キーを使用してハンドル ポイントを調整し、カーブの方向と強度を調整します。詳細を追加するには、Shift キーを押しながら、隣接する 2 つの制御点を選択します。次に、右クリックして[細分化]を選択し、それらの間に新しい点を挿入します。曲線が背骨の輪郭を正確に描いたら、[レイアウト]タブに入り、ベジェ円オブジェクトを右クリックして、マウスを動かさずに[オブジェクトを複製]を選択します。結合されたオブジェクトのエッジを接続して閉じたメッシュを形成するには、[モデリング]タブに入ります。2を押して、エッジセレクトモードに切り替えます。[選択](Select)、[すべて](All)の順にクリックし、右クリックして[エッジ ループをブリッジ](Bridge Edge Loops)を選択して、エッジ リングをリンクします。オブジェクトの上部のギャップを埋めるには、オブジェクトの横にある をクリックして、すべての選択を解除します。Alt キーを押しながら上部の棚の 1 つのエッジをクリックして、ループ全体を選択します。右クリックして[エッジを押し出し]を選択し、Z 軸に沿って上向きにドラッグします。次に、s キーを押し、マウスを内側に移動して新しいループを縮小し、クリックして確定します。ループを選択した状態で右クリックして、[エッジから新しい面]を選択します。最終的な構造を滑らかにするには、右側のサイドバーの [修飾子] タブに移動します。モディファイヤを追加(Add Modifier)をクリックし、生成(Generate)に移動して、サブディビジョン サーフェス(Subdivision Surface)を選択します。ビューポートとレンダリング レベルを 1 に設定して、一貫したスムージングを実現します。個々の構造物に色を割り当てるには、目的のオブジェクトを選択します。右側のサイドバーの [材料] タブを開き、[新規] をクリックして、ベース カラーを設定します。ライト オブジェクトを選択して、シーンの照明を調整します。g を押したままマウスを動かしてライトの位置を変更し、クリックして新しい位置を確認します。レンダリング用にカメラを配置するには、最終出力に表示される樹状突起の背骨を向くようにビューポートの向きを合わせます。Control + Alt + テンキー 0 を押して、カメラを現在のビューにスナップします。カメラフレームを選択し、g を押しながら移動してフレーミングを調整します。マウスの体性感覚皮質は、染色されていない脳切片でも識別可能であり、個々のバレルが複数のセクションに分散しているにもかかわらず、バレルフィールド全体をデジタルツールを使用して再構築できました。連続した超薄型TEM画像により、連続した視覚的証拠に基づいて、シナプスを興奮性タイプまたは抑制性タイプに確実に分類することができました。連続切片からの樹状突起棘の 3 次元再構成により、脊椎の形態を視覚化し、細い、キノコ、ずんぐりした棘、中間などのさまざまな形状を明らかにしました。背骨の形状は、背骨の長さ、首の長さ、背骨、頭、首の直径などの測定値に基づいて定量化されました。