Name: SARS-CoV-2ウイルス様粒子系の作製によるウイルスライフサイクルの in vitro (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-06T15:57:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: 学ぶSARS-CoV-2ウイルス様粒子の作製法。HEK-293T細胞を用いて感染性のないVLPを産生し、BSL-3不要でウイルス感染・組み立て機構を安全に研究できます。創薬スクリーニングにも応用可能です。

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<ol><li>Narayanan, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+SARS-CoV-2+and+COVID-19+review%2C+Part+2%3A+host+extracellular+to+systemic+effects+of+SARS-CoV-2+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">A comprehensive SARS-CoV-2 and COVID-19 review, Part 2: host extracellular to systemic effects of SARS-CoV-2 infection.</a> Eur J Hum Genet. 32 (1), 10-20 (2024).</li>
<li>Shang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+receptor+recognition+by+SARS-CoV-2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural basis of receptor recognition by SARS-CoV-2.</a> Nature. 581 (7807), 221-224 (2020).</li>
<li>Lan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+SARS-CoV-2+spike+receptor-binding+domain+bound+to+the+ACE2+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the SARS-CoV-2 spike receptor-binding domain bound to the ACE2 receptor.</a> Nature. 581 (7807), 215-220 (2020).</li>
<li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+SARS-CoV-2+membrane+protein+essential+for+virus+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Structure of SARS-CoV-2 membrane protein essential for virus assembly.</a> Nat Commun. 13 (1), 4399(2022).</li>
<li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+N+protein+coordinates+viral+particle+assembly+through+multiple+domains%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 N protein coordinates viral particle assembly through multiple domains.</a> J Virol. 98 (11), e0103624(2024).</li>
<li>Ghosh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta-coronaviruses+use+lysosomes+for+egress+instead+of+the+biosynthetic+secretory+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">beta-coronaviruses use lysosomes for egress instead of the biosynthetic secretory pathway.</a> Cell. 183 (6), 1520-1535.e14 (2020).</li>
<li>Andrews, H. S., Herman, J. D., Gandhi, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatments+for+COVID-19%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Med%22%5BJournal%5D)">Treatments for COVID-19.</a> Annu Rev Med. 75, 145-157 (2024).</li>
<li>Crawford, K. H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+and+reagents+for+pseudotyping+lentiviral+particles+with+SARS-CoV-2+spike+protein+for+neutralization+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Protocol and reagents for pseudotyping lentiviral particles with SARS-CoV-2 spike protein for neutralization assays.</a> Viruses. 12 (5), 513(2020).</li>
<li>Sultana, R., Stahelin, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strengths+and+limitations+of+SARS-CoV-2+virus-like+particle+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Strengths and limitations of SARS-CoV-2 virus-like particle systems.</a> Virology. 601, 110285(2025).</li>
<li>Xu, R., Shi, M., Li, J., Song, P., Li, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+SARS-CoV-2+virus-like+particles+by+mammalian+expression+system%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioeng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Construction of SARS-CoV-2 virus-like particles by mammalian expression system.</a> Front Bioeng Biotechnol. 8, 862(2020).</li>
<li>Plescia, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+viral+budding+and+entry+can+be+modeled+using+BSL-2+level+virus-like+particles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 viral budding and entry can be modeled using BSL-2 level virus-like particles.</a> J Biol Chem. 296, 100103(2021).</li>
<li>Cruz-Cardenas, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pseudovirus-based+platform+to+measure+neutralizing+antibodies+in+Mexico+using+SARS-CoV-2+as+proof-of-concept%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A pseudovirus-based platform to measure neutralizing antibodies in Mexico using SARS-CoV-2 as proof-of-concept.</a> Sci Rep. 12 (1), 17966(2022).</li>
<li>Syed, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+assessment+of+SARS-CoV-2-evolved+variants+using+virus-like+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Rapid assessment of SARS-CoV-2-evolved variants using virus-like particles.</a> Science. 374 (6575), 1626-1632 (2021).</li>
<li>Hoffmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+cell+entry+depends+on+ACE2+and+TMPRSS2+and+is+blocked+by+a+clinically+proven+protease+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and is blocked by a clinically proven protease inhibitor.</a> Cell. 181 (2), 271-280 (2020).</li>
<li>Matsuyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+isolation+of+SARS-CoV-2+by+TMPRSS2-expressing+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Enhanced isolation of SARS-CoV-2 by TMPRSS2-expressing cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 117 (13), 7001-7003 (2020).</li>
<li>Alegria-Schaffer, A., Lodge, A., Vattem, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performing+and+optimizing+Western+blots+with+an+emphasis+on+chemiluminescent+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Performing and optimizing Western blots with an emphasis on chemiluminescent detection.</a> Methods Enzymol. 463, 573-599 (2009).</li>
<li>V'Kovski, P., Kratzel, A., Steiner, S., Stalder, H., Thiel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronavirus+biology+and+replication%3A+implications+for+SARS-CoV-2%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Coronavirus biology and replication: implications for SARS-CoV-2.</a> Nat Rev Microbiol. 19 (3), 155-170 (2021).</li>
<li>Yang, H., Rao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+biology+of+SARS-CoV-2+and+implications+for+therapeutic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Structural biology of SARS-CoV-2 and implications for therapeutic development.</a> Nat Rev Microbiol. 19 (11), 685-700 (2021).</li>
<li>Katiyar, H., Arduini, A., Li, Y., Liang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+assembly%3A+Gaining+infectivity+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 assembly: Gaining infectivity and beyond.</a> Viruses. 16 (11), 1648(2024).</li>
<li>Klein, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+structure+and+replication+characterized+by+in+situ+cryo-electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 structure and replication characterized by in situ cryo-electron tomography.</a> Nat Commun. 11 (1), 5885(2020).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+spike+host+cell+surface+exposure+promoted+by+a+COPI+sorting+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Pharm+Sin+B%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 spike host cell surface exposure promoted by a COPI sorting inhibitor.</a> Acta Pharm Sin B. 13 (7), 3043-3053 (2023).</li>
<li>Dey, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+C-terminal+residue+controls+SARS-CoV-2+spike+trafficking+and+incorporation+into+VLPs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A single C-terminal residue controls SARS-CoV-2 spike trafficking and incorporation into VLPs.</a> Nat Commun. 14 (1), 8358(2023).</li>
<li>Christie, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-virus+tracking+reveals+variant+SARS-CoV-2+spike+proteins+induce+ACE2-independent+membrane+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Single-virus tracking reveals variant SARS-CoV-2 spike proteins induce ACE2-independent membrane interactions.</a> Sci Adv. 8 (49), eabo3977(2022).</li>
<li>Guo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targetable+elements+in+SARS-CoV-2+S2+subunit+for+the+design+of+pan-coronavirus+fusion+inhibitors+and+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduct+Target+Ther%22%5BJournal%5D)">Targetable elements in SARS-CoV-2 S2 subunit for the design of pan-coronavirus fusion inhibitors and vaccines.</a> Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 197(2023).</li>
<li>Mi, D., Hu, J., Qian, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lentiviral+pseudotype+system+to+characterize+SARS-CoV-2+glycoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A lentiviral pseudotype system to characterize SARS-CoV-2 glycoprotein.</a> Methods Mol Biol. 2610, 187-199 (2023).</li>
<li>Swann, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+system+for+assembly+of+SARS-CoV-2+virus+like+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Minimal system for assembly of SARS-CoV-2 virus like particles.</a> Sci Rep. 10 (1), 21877(2020).</li>
<li>Xia, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+mediate+antibody-resistant+transmission+of+SARS-CoV-2%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Discov%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles mediate antibody-resistant transmission of SARS-CoV-2.</a> Cell Discov. 9 (1), 2(2023).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>ウシ血清アルブミン (BSA)</td><td>細胞シグナル伝達技術</td><td>9998S</td><td></td></tr><tr><td>共焦点レーザー走査顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>FV3000</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>コーニング</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>サーモフィッシャー</td><td>A5670402</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗マウス IgG H&L (Alexa Fluor 488) 抗体</td><td>Invitrogen</td><td>A11001</td><td>希釈比: IF 1:1000</td></tr><tr><td>ヤギ抗ウサギ IgG H&L (Alexa Fluor 594) 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab150080</td><td>希釈比: IF 1:1000</td></tr><tr><td>HEK-293T 細胞株</td><td>National Infrastructure of Cell Line Resource (NICR)NICR-293T-001</td><td></td> <td>高いトランスフェクション効率と最適な SC2-VLP 産生を確保するには、HEK-293T 細胞を低い継代数 (&le;P10)。</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H1399</td><td>作業濃度: 2.5 &g/mL</td></tr><tr><td>ルシフェラーゼ レポーター アッセイ システム</td><td>Promega</td><td>E1500</td><td></td></tr><tr><td>Luc-T20</td><td>Addgene</td><td>177941</td><td></td></tr><tr><td>マウス モノクローナル抗 GAPDH</td><td>Proteintech</td><td>60004-1-Ig</td><td>希釈比: WB 1:20,000</td></tr><tr><td>マウス モノクローナル抗 S RBD</td><td>アブクローナル</td><td>A23771</td><td>希釈比: IF 1:200</td></tr><tr><td>OptiMEM</td><td>Thermofisher</td><td>31985070</td><td>トランスフェクション用無血清培地</td></tr><tr><td>PEG3350</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3635</td><td></td></tr><tr><td>PEG8000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2139</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>Thermofisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>ポリエチレンイミン (PEI)</td><td>Thermofisher</td><td>43896.01</td><td></td></tr><tr><td>Promega 受動溶解バッファー</td><td>Promega</td><td>E1941</td><td></td></tr><tr><td>ウサギポリクローナル抗ACE2</td><td>Proteintech</td><td>21115-1-AP</td><td>希釈比:WB 1:1000</td></tr>ウ<tr><td>サギポリクローナル抗ERGIC53</td><td>Proteintech</td><td>13364-1-AP</td>希<td>釈比:IF 1:200</td></tr>ウ<tr><td>サギポリクローナル抗GM130</td><td>Proteintech</td><td>11308-1-AP</td>希<td>釈比:IF 1:200</td></tr>ウ<tr><td>サギポリクローナル抗S</td><td>Abcam</td><td>ab272504</td>希<td>釈比:WB 1:1000</td></tr><tr><td>ウサギポリクローナル抗Sec61&β;</td><td>Proteintech</td><td>15087-1-AP</td><td>希釈比:IF 1:200</td></tr><tr><td>ウサギポリクローナル抗TMPRSS2</td><td>Abcam</td><td>ab109131</td>希<td>釈比:WB 1:1000</td></tr><tr><td>SARS-CoV-2 M-IRES-Eプラスミド</td><td>Addgene</td><td>177938</td><td></td></tr><tr><td>SARS-CoV-2 Nプラスミド</td><td>Addgene</td><td>177959</td><td></td></tr><tr><td>SARS-CoV-2 Nucleoprotein Rabbit mAb</td><td>Abclonal</td><td>A21042</td>希<td>釈比:WB 1:4000</td></tr><tr><td>SARS-CoV-2 S プラスミド</td><td>Addgene</td><td>177960</td><td></td></tr><tr><td>二次抗体、HRP、ヤギ抗マウス IgG (H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>31460</td><td>希釈比: WB 1:5000</td></tr><tr><td>二次抗体、HRP、ヤギ抗ウサギ IgG (H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>31430</td><td>希釈比: WB 1:5000</td></tr><tr><td>SpectraMax i3x プレートリーダー&nbsp;</td><td>分子デバイス</td><td>SpectraMax i3x</td><td></td></tr></tbody></table>

sars-cov-2ウイルス様粒子系の作製によるウイルスライフサイクルの in vitro

Production of a SARS-CoV-2 Virus-Like-Particle System to Investigate Viral Life Cycles In Vitro

SARS-CoV-2のライフサイクルの出口と組み立てのステップは、感染と複製のステップ17,18よりも研究されていません。SC2-VLP法が開発される前は、これらのプロセスは生きたSARS-CoV-2を使用してのみ調査することができ、研究はBSL-3研究所に限定されていました13。図1に示すSC2-VLPワークフローは、実験プロトコルの概要を示し、SARS-CoV-2ライフサイクルのこれらのステップに関与するプロセスを示しています。このアプローチでは、SARS-CoV-2の構造タンパク質(M、E、S、N)とRNAパッケージングシグナル(T20)をコードするプラスミドをHEK-293T細胞に同時トランスフェクトします。T20シグナルに融合したルシフェラーゼレポーターにより、放出されたSC2-VLPを高感度に検出でき、図1に示すように、SARS-CoV-2受容...

SARS-CoV-2ウイルス様粒子系の作製によるウイルスライフサイクルの in vitro

The severe acute respiratory syndrome-coronavirus 2 (SARS-CoV-2) virus-like particle (SC2-VLP) method offers a powerful and accessible tool for studying ...

production-sars-cov-2-virus-like-particle-system-to-investigate-viral

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

Source: Jamieson, T. R., et al. Detection of SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies using High-Throughput Fluorescent Imaging of Pseudovirus Infection. J. Vis. Exp. (2021)This video demonstrates the procedure for infecting mammalian cells with green fluorescent protein (GFP)-encoding pseudovirus, monitoring viral replication and spread by fluorescence microscopy, and collecting virus-containing supernatant for downstream applications.

Production and Collection of Pseudovirus Particles Using Mammalian Cell Culture

Source: Scarborough, R. J., et al. Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy. J. Vis. Exp. (2016).This video demonstrates a reverse transcriptase (RT) assay to assess the effect of a test RNA on virus-like particle (VLP) production. Cells are co-transfected with plasmids, and RT activity is measured as a quantitative indicator of VLP output. A decrease in RT activity reflects suppression of viral gene expression by the test RNA.

Reverse Transcriptase Activity as a Marker for Virus-Like Particle Production

レポーター含有エボラウイルス転写・複製能を有するウイルス様粒子（trVLPs）の作製

出典：Chen, Z., et al. Making Conjugation-induced Fluorescent PEGylated Virus-like Particles by Dibromomaleimide-disulfide Chemistry. J. Vis. Exp. (2018)このビデオでは、遺伝子組み換え E.

遺伝子組換えE. coliにおけるウイルス様粒子の作製

このビデオは、哺乳類のシステムでインフルエンザウイルス様粒子(VLP)を生成する方法を示しています。3つの真核生物の発現ベクター(異なるウイルス構造タンパク質をコードする)を適切な哺乳類宿主細胞に発現させると、発現したウイルスタンパク質は宿主の原形質膜上でVLPに自己組織化し、細胞表面から出芽して放出されます。...

哺乳類系を介したインフルエンザウイルス様粒子の生成技術

感染エボラウイルスでの作業は、バイオセーフティーレベル4の研究室に限定されています。粒子（trVLPs）のようなTetracistronicミニゲノム含有複製と転写可能ウイルスは、私たちが安全にエボラウイルスのコンポーネントのみに頼って、バイオセーフティーレベル2の条件で複数の感染サイクルをモデル化することを可能にするライフサイクルモデリングシステムを表している。...

Tetracistronicミニゲノムを含むウイルス様粒子とバイオセーフティレベル2の条件の下ではエボラウイルスのライフサイクルのモデル化

ここでは、高病原性ウイルス中東呼吸器症候群、重症急性呼吸器症候群コロナのスパイク ・ プロテインを組み込む BSL 2 設定で新規のパーティクルを生成するプロトコルを提案する.これら新規粒子には、ターゲット ホストの細胞にウイルスのエントリの定量化を許可するルシフェラーゼ...

バイオ セーフティ レベル 2 の設定で高病原性コロナを勉強する新規微粒子の製造

ここで説明するプロトコルは、スパイク糖タンパク質に擬似的に結合した強化された緑色蛍光タンパク質標識付き小胞性口内炎ウイルスによる感染を阻害する回復血清サンプルの能力を評価することによって、SARS-CoV-2スパイクタンパク質に対する中和抗体を測定するための迅速かつ効果的な方法を概説する。...

疑似ウイルス感染のハイスループット蛍光イメージングを用いたSARS-CoV-2中和抗体の検出

このプロトコルは、インビボでSARS-CoV-2感染を研究するために必要な二次的アプローチの必要性を克服するために、K18...

レポーター発現組換えSARS-CoV-2を用いたK18 hACE2トランスジェニックマウスにおけるウイルス感染のライブイメージングと定量

偽型ウイルス(PV)は、複製欠損のあるウイルス粒子であり、本物のウイルスを扱うよりも安全な条件下で宿主とウイルスの相互作用を研究するために使用されます。ここでは、SARS-CoV-2...

中和アッセイを介してSARS-CoV-2に対する体液性免疫応答を監視するための分子ツールとしての偽型ウイルス

本記事では、ルシフェラーゼレポーターシステムを用いてSARS-CoV-2疑似型粒子を生成する方法論と、それを用いたエントリー阻害剤の同定について説明しています。これらのプロトコルは、組換えヒトACE2-Fc融合タンパク質と小分子化合物アルビドールという2種類のエントリー阻害剤を用いて実証されています。...

MLVベースの偽ウイルスを用いたSARS-CoV-2侵入阻害薬の潜在的な抗ウイルス薬同定の手順

学ぶSARS-CoV-2ウイルス様粒子の作製法。HEK-293T細胞を用いて感染性のないVLPを産生し、BSL-3不要でウイルス感染・組み立て機構を安全に研究できます。創薬スクリーニングにも応用可能です。

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