SARS-CoV-2ウイルス様粒子系の作製によるウイルスライフサイクルの in vitro

私たちは、本物のウイルスを密接に模倣したSARS-CoV-2ウイルス様粒子を生成するための最適化された in vitro プロトコルを提示します。このアプローチにより、バイオセーフティレベル3の実験室を必要とすることなく、ウイルスの感染、組み立て、および出口メカニズムの調査が可能になります。

私たちの研究は、SARS-CoV-2ウイルスの生物学を理解し、特にSARS-CoV-2に対する漢方薬から薬を見つけようとしています。すべての生きたSARS-CoV-2ウイルス研究は、バイオセーフティレベル3のラボで管理されなければなりません。そして、この実験上の限界により、SARS-CoV-2 研究はほんの一握りの人生でのみ実現可能になります。SARS-CoV-2 ウイルスのような SARS-CoV-2 に関する研究の実践的な方法は、バイオセーフティ レベル 3 のラボに制限されることなく可能であり、リストは非常に有用な方法になります。

[講師]まず、直径10センチメートルの組織培養プレートに約300万個のHEK-293T細胞をDMEM完全培地で播種し、10%FBSと1%ペニシリン-ストレプトマイシンを添加します。細胞を摂氏37度、二酸化炭素5%で約24時間培養します。顕微鏡下で細胞の共同流暢度を確認します。1ミリリットルあたり1ミリグラムの原液から60マイクロリットルのPEIを無血清培地で希釈し、最終容量200マイクロリットルに達します。次に、200マイクロリットルの無血清培地を取り、6.7マイクログラムのNプラスミド、10マイクログラムのLuc-T20プラスミド、0.016マイクログラムのSプラスミド、および3.3マイクログラムのM-IRES-Eプラスミドを加えます。希釈したPEI溶液を、ウイルス構造タンパク質用のプラスミドコーティングを含む溶液にそっと加え、混合物を室温で10分間インキュベートします。これがトランスフェクション溶液です。トランスフェクション溶液をHEK-293T細胞に慎重に滴下し、組織培養プレートを穏やかに回転させて完全に混合します。感染後6時間で細胞培養培地をDMEM完全培地と交換し、トランスフェクトされたHEK-293T細胞を摂氏37度で5%二酸化炭素とともに48時間インキュベートします。SARS-CoV-2 ウイルス様粒子を含む感染した HEK-293T 細胞の上清を収集します。収集した上清を0.45マイクロメートルのシリンジフィルターでろ過し、細胞の破片を除去します。これは SC2-VLP メディアです。アンジオテンシン変換酵素2(ACE2)を安定して発現するHEK-293T細胞40,000個を播種し、96ウェルプレートにTMPRSS2し、50マイクロリットルのSC2-VLP培地を加えます。96ウェル組織培養プレートを摂氏37度で5%二酸化炭素とともに24時間インキュベートします。インキュベーション後、96ウェルプレートの各ウェルから培地を取り出し、摂氏37度に予熱した100マイクロリットルのPBSで1回洗浄します。ACE2 TMPRSS2細胞を播種したHEK-293T細胞を20マイクロリットルのパッシブ溶解バッファーで溶解し、室温で15分間オービタルシェーカーでサンプルを穏やかに揺らします。冷蔵マイクロプレート遠心分離機を使用して、96ウェルプレートを摂氏4度で4,000 Gで15分間回転させ、すぐにプレートを氷浴に移します。100マイクロリットルの再構成ルシフェラーゼアッセイバッファーを新しい不透明な白色96ウェルプレートに取り、各ウェルに20マイクロリットルのライセートを加えます。上下に2〜3回ピペッティングして短時間混合します。プレートリーダーを使用して発光信号を測定します。次に、SC2-VLP培地の組成を評価するために、1.36ミリリットルのPEG 8000溶液を10ミリリットルのSC2-VLP培地に加えます。混合物をオービタルシェーカーに置き、摂氏4度で一晩ゆっくりと混合します。溶液を摂氏4度、2,000 Gで30分間遠心分離します。そして、ウェスタンブロッティング分析のためにSC2-VLPペレットを収集します。直径15mmのガラス底培養皿に約300万個のHEK-293T細胞を均一に播種し、細胞が約70%のコンフルエンシーに達するまで接着して増殖させます。修飾プラスミド量で前述のように細胞をトランセクトした後、培養皿を1ミリリットルの氷冷PBSで2回穏やかに洗浄します。1ミリリットルの4%パラホルムアルデヒド固定溶液を室温で加え、15分間インキュベートします。室温で1ミリリットルのPBSで細胞を5分間2回洗浄し、1ミリリットルの0.25%Triton X-100を10分間加えて細胞を透過処理します。再び、室温で1ミリリットルのPBSで細胞を5分間2回洗浄します。次に、1ミリリットルの5%ウシ血清アルブミンを1時間加えて、非特異的抗体相互作用をブロックします。ガラスの底を覆うために約200マイクロリットルの一次抗体溶液を加え、摂氏4度で一晩インキュベートします。次に、一次抗体溶液を取り出し、室温で1ミリリットルのPBSで細胞を5分間3回洗浄します。 次に、蛍光結合二次抗体溶液を加え、室温で1時間インキュベートします。細胞をPBSで3回洗浄した後、室温で1ミリリットルあたり2.5マイクログラムのHoechst溶液で核を5分間染色します。最後に、PBSで細胞を洗浄した後、Sタンパク質または細胞小器官の染色を観察してから、共焦点顕微鏡を使用して画像を取得します。この図は、スパイクタンパク質をコードするプラスミドのトランスフェクション量の変化に対するSC2-VLP産生の感受性を示しています。SC2-VLP力価は、0.016マイクログラムのSプラスミドをトランスフェクトしたときに最も高く、0.16および1.6マイクログラムのSプラスミドで有意に減少しました。スパイクタンパク質のH1271からEへの変異は、野生型と比較してSC2-VLP力価を有意に低下させました。E1262からHへの変異はSC2-VLP力価の中程度の減少につながりましたが、E1262からH、H1271からEへの二重変異は産生を完全に廃止しました。全長SおよびS-2タンパク質バンドは、野生型と比較して、E1262からHおよび二重変異レーンで減少しました。Sパッケージング効率も、E1262からHへ、H1271からE変異体では低下し、二重変異体ではほぼ廃止されました。VLPの存在量は、野生型およびすべてのS変異体でほとんど変化しませんでした。野生型Sタンパク質は、シスゴルジマーカーGM130と共局在しているが、ERマーカーSec61ベータまたはERGICマーカーERGIC 53とは共局在していない。H1271からEへの変異Sタンパク質は、びまん性細胞質分布を示し、GM130との共局在を欠いていました。