シロイヌナズナロゼットを用いた葉表面とアポプラスドRNAの単離と解析の段階的ガイド
2025年8月8日
シロイヌナズナ植物の葉の表面とアポプラストから細胞外RNAを単離するためのシンプルでありながら再現性の高い方法について説明します。
私たちは、植物がどのようにマイクロバイオームを調節しているのか、また、植物が分泌するRNAが、植物にコロニーを形成している原核微生物と真核生物の微生物の両方で遺伝子発現を調節しているかどうかを理解しようとしています。高分解能シェル電気泳動とイルミナベースの分析を組み合わせて、葉の表面に存在するRNAと、生物的ストレスに応答してそれらがどのように変化するかを評価します。最近の研究では、細胞外RNAが真菌や細菌の病原体によって取り込まれることが示唆されていますが、RNA取り込みの根底にあるメカニズムとこの取り込みの機能的影響はほとんど解明されていません。
まず、複製ごとに生後6〜7週間のシロイヌナズナ植物を取ります。葉表面洗浄の分離を開始する前に、シルエットL-77を滅菌VIBに追加します。次に、測定シリンダーを使用して、調製したVIB溶液100ミリリットルを500ミリリットルのスプレーボトルに移します。
細いはさみを使用して、シロイヌナズナのロゼットを根元から慎重に切り離します。その後、柔らかいブラシを使用して花びらから余分な汚れを取り除きます。取り外したロゼットを、遠軸面を上に向けて平らなトレイに置きます。
次に、VIBと湿潤剤を充填したスプレーボトルの5つのポンプを使用して、遠軸面をスプレーします。ロゼットを慎重に裏返し、近軸面にスプレーします。底部に穴の開いた改造注射器を首にパラフィルムで巻き付けて、先端をボトルの底の上に吊り下げて準備します。
葉の表面洗浄を回収するには、スプレーされたロゼットを250ミリリットルの遠心分離機ボトル内に配置された無針60ミリリットルの変性シリンジにそっと挿入し、シリンジにバッファーの2つのしっかりとしたポンプをスプレーします。次に、ロードされたボトルを摂氏4度で10分間100Gで遠心分離します。次に、回収された葉の表面洗浄液を0.22マイクロメートルのシリンジフィルターでろ過し、濾液を氷上に保った50ミリリットルの遠心分離管に回収します。
葉表面綿棒法では、前のステップで説明したのと同じ方法で、剥がしたロゼットにVIBと湿潤剤溶液をスプレーします。葉の表面綿棒を回収するには、滅菌綿先スティックを使用して、ロゼットの近軸面と遠軸面の両方を綿棒で拭きます。次に、浸した先端を15ミリリットルの遠心分離管の内壁に押し付けて液体を抽出します。
抽出した葉表面綿棒サンプルを、0.22マイクロメートルのシリンジフィルターを通して氷の上に置かれた2ミリリットルのチューブにろ過します。以前に葉の表面洗浄または綿棒の分離に使用したのと同じ植物セットを清潔なビーカーに入れ、蒸留水で2回優しくすすいでください。VIBでロゼットを真空浸透させるには、すすぎたロゼットを300〜500ミリリットルのVIBを含むフレンチプレスコーヒーメーカーに慎重に入れます。
蓋を固定し、ロゼットが完全に水没するまでプランジャーをゆっくりと下げます。フレンチプレスを真空チャンバーに挿入し、植物が十分に浸透するまで真空ポンプを使用して20秒間真空をかけます。真空を解放した後、フレンチプレスをチャンバーから取り外し、蓋を外します。
VIBを500ミリリットルのプラスチックビーカーに注ぎ、ロゼットを取り外します。次に、ロゼットを軽く振って、葉をペーパータオルに刷毛で塗り、余分な緩衝液を取り除きます。次に、あぶらとり紙を使用して、葉の表面を優しく吸い取り、残っている緩衝液を取り除きます。
非プラスチック洗浄液を回収するには、VIB浸潤ロゼットを60ミリリットルの無針注射器に挿入し、以前と同様に250ミリリットルの遠心分離機ボトルの中に入れます。ボトルを600 Gで摂氏4度で30分間、ゆっくりと加速しながら遠心分離します。次に、氷の上に置かれた15ミリリットルのチューブ内の0.22マイクロメートルのシリンジフィルターを通して、プールされた非プラスチック洗浄液をろ過します。
アクリルアミドとビス溶液を使用して、トリスボ酸EDTA緩衝液に10%または15%のポリアクリルアミドと7モル尿素を含むミニゲルを調製または購入します。次に、RNAサンプルを2倍変性ローディングバッファーと混合します。混合物を摂氏65度で5分間加熱し、すぐに氷の上に置きます。
次に、220ボルトを約1時間15分間印加することにより、室温で0.5倍のTBEランニングバッファーでRNAサンプルを分離します。次に、ゲルをサイバーゴールド核酸ゲル染色で0.5倍TBEで10分間染色します。ゲルを蒸留水で2回すすぎ、イメージングシステムを使用して画像化します。
分離されたRNAバンドを定量するには、分析およびゲル分析メニューのImage Jドキュメントのゲル分析法を使用します。細胞溶解物RNAをRNaseおよびDNaseフリー水で希釈することにより、2つの技術的複製用のRNA標準試料を調製します。1.5倍のサイバーゴールド核酸ゲル染色剤を調製するには、pH 8の500ミリモルトリスHCLバッファーに溶解します。
マイクロプレートをセットアップするには、各ウェルに99マイクロリットルの蒸留水を加えます。次に、RNAサンプルと標準試料の両方に同じ容量を使用して、各ウェルに1マイクロリットルのRNAを追加します。最後に、各ウェルに50マイクロリットルのサイバーゴールド溶液を追加します。
マイクロプレートリーダーのパラメータを設定するには、3秒間の線形または軌道振とうのいずれかを選択します。マイクロプレートリーダーを、励起波長496ナノメートル、発光波長540ナノメートルの蛍光エンドポイントモードに設定します。RNA標準の蛍光強度値を使用して、キャリブレーションラインを構築します。
変性RNAゲル分析により、葉表面洗浄液サンプルと非再生洗浄液サンプルの両方に、長尺RNA種と低分子RNA種の両方を含む幅広いRNAサイズが含まれていることが明らかになりました。再生不能洗浄液と葉表面洗浄液から単離された総RNA量は、植物の新鮮な体重に正規化した場合、同様でした。葉表面洗浄液、非可塑性洗浄液、および細胞溶解物のRNAプロファイルは著しく異なり、細胞内RNA汚染が最小限であることを確認し、小胞単離バッファーに0.001%シルエットL-77を添加したばまん性低分子量バンドでアプレーズRNAが高度に処理されることを示し、湿潤剤を使用しないバッファと比較して葉表面からのRNA収量がほぼ2倍になりました。
しかし、この濃度を0.01%に上げても、RNAの回収率はさらに向上しませんでした。同じ葉の2回目の洗浄では、最初の洗浄で得られたRNAの約63%が回収され、葉の表面へのRNA分泌が進行中であることが示されました。蛍光ベースのマイクロタイタープレートアッセイを使用したRNA定量は、サイバーゴールドとRIBO 488の両方の検出法でRNA濃度の高い直線性を示しました。
tRNAおよびtRNA由来フラグメント、またはTDRは、おそらく分解に対する耐性により、細胞外RNAに特に豊富に存在することを示しました。したがって、これらのTDRは細菌の遺伝子発現を調節している可能性が高いと考えています。私たちは、葉表面RNAの細胞源と、計画された微生物相互作用の文脈でこの葉表面RNaseが果たしている可能性のある生物学的役割を特定したいと考えています。
概要
この研究は、アラブイデプシス植物の葉面とアポプラストから細胞外RNAを単離する再現可能な方法を提示します。この手法は、生物的ストレスに対するRNAダイナミクスを調査するために高解像度のシェル電気泳動とIlluminaベースの分析を組み合わせています。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 植物分子生物学
- RNA生物学
- マイクロバイオーム相互作用
背景
- 植物と微生物の相互作用の理解は農業の進歩にとって重要です。
- 細胞外RNAは微生物の遺伝子発現の調節に役割を果たす可能性があります。
- 微生物によるRNAの取り込みに関する現在の知識は限られています。
- アラブイデプシスはこれらの相互作用を研究するためのモデル生物として機能します。
研究の目的
- アラブイデプシスから細胞外RNAを単離し分析すること。
- 生物的ストレス下でのRNAプロファイルの変化を評価すること。
- 植物分泌RNAの潜在的な機能的役割を探索すること。
使用された方法
- VIB溶液を用いた葉面洗浄液とアポプラスト洗浄液の単離。
- RNAプロファイリングのための高解像度のシェル電気泳動。
- RNA特性化のためのIlluminaベースの分析。
- ゲル分析とマイクロプレートリーダーを用いたRNAの定量化。
主要な結果
- 葉面洗浄液とアポプラスト洗浄液の両方に様々なサイズのRNAが含まれています。
- ウェッティング剤の添加によりRNAの収率が大幅に改善されました。
- 細胞内RNA汚染が最小限であることが確認されました。
- 異なるサンプルタイプ間で異なるRNAプロファイルが観察されました。
結論
- この方法は植物における細胞外RNAを研究するための信頼できる方法を提供します。
- この発見は植物と微生物の相互作用の理解に貢献します。
- これらのRNAの機能的役割を解明するにはさらなる研究が必要です。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Isolation and quantitative analysis of extracellular RNA (exRNA) from Arabidopsis leaf surfaces and apoplast enables mechanistic interrogation of plant-microbe molecular exchange. This workflow supports predictive confidence in understanding RNA-mediated signaling and its impact on microbial gene regulation. The protocol's reproducibility and quantitative rigor position it as a foundational tool for early discovery and target validation in plant-microbe interaction studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables hypothesis-driven investigation of RNA secretion and uptake mechanisms at the plant-microbe interface.
- Supports functional target validation by distinguishing extracellular from intracellular RNA populations.
- Facilitates mechanistic de-risking by quantifying RNA species and their potential regulatory roles.
Screening & Assay Development
- Provides validated protocols for isolating and quantifying exRNA from distinct plant compartments.
- Standardizes sample preparation and filtration to minimize contamination and maximize reproducibility.
- Generates quantitative outputs suitable for downstream comparative and screening assays.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker discovery by enabling molecular profiling of plant responses to biotic stress.
- Supports continuity from discovery to preclinical validation of RNA-mediated plant-microbe interactions.
- Offers predictive value for identifying RNA species with potential regulatory impact on microbial communities.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from early mechanistic studies to preclinical model development in plant-microbe research.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing on RNA secretion, uptake, and functional consequences in plant-microbe systems.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative exRNA profiles for comparative analysis across experimental conditions.
- Analytics: Employs gel electrophoresis and fluorescence-based quantification for robust measurement of RNA species.
- Translational Research: Facilitates identification of candidate RNA biomarkers relevant to plant health and microbial modulation.
- Enterprise Reuse: Protocol is adaptable for diverse plant systems and scalable for high-throughput applications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in plant-microbe molecular exchange and target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable RNA isolation and analysis workflows.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by providing quantitative, contamination-minimized exRNA data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of plant-microbe interaction targets and mechanistic hypotheses.
Implementation Considerations
- Requires expertise in plant molecular biology and RNA handling.
- Needs access to centrifugation, filtration, gel electrophoresis, and fluorescence quantification instrumentation.
- Demands rigorous cross-team standardization to ensure reproducibility and data comparability.
- Adaptable to other plant models with protocol optimization for tissue type and RNA yield.
- RNA yield and contamination risk are influenced by buffer composition and filtration stringency.
