Name: マントル細胞リンパ腫の 3D モデルとしてのヒドロゲル腫瘍スライスのバイオプリンティング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-09-12T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: 学ぶマントル細胞リンパ腫の3Dバイオプリンティングモデル。アルジネートとコラーゲンのバイオインクを用いて水ゲル腫瘍スライスを作成し、薬剤耐性メカニズムを解析します。Jeko-1細胞の生存率80%を維持し、2D培養より生理学的に優れた腫瘍微小環境を再現できます。

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<ol><li>Jain, P., Wang, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mantle+cell+lymphoma+in+2022-a+comprehensive+update+on+molecular+pathogenesis%2C+risk+stratification%2C+clinical+approach%2C+and+current+and+novel+treatments%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hematol%22%5BJournal%5D)">Mantle cell lymphoma in 2022-a comprehensive update on molecular pathogenesis, risk stratification, clinical approach, and current and novel treatments.</a> Am J Hematol. 97 (5), 638-656 (2022).</li>
<li>Lee, J., Cuddihy, M. J., Kotov, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cell+culture+matrices%3A+State+of+the+art%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+B+Rev%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cell culture matrices: State of the art.</a> Tissue Eng Part B Rev. 14 (1), 61-86 (2008).</li>
<li>Wen, T., Wang, J., Shi, Y., Qian, H., Liu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitors+targeting+Bruton%27s+tyrosine+kinase+in+cancers%3A+Drug+development+advances%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Inhibitors targeting Bruton's tyrosine kinase in cancers: Drug development advances.</a> Leukemia. 35 (2), 312-332 (2021).</li>
<li>Lee, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+1%2F2+study+of+zilovertamab+and+ibrutinib+in+mantle+cell+lymphoma+%28mcl%29+or+chronic+lymphocytic+leukemia+%28cll%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Phase 1/2 study of zilovertamab and ibrutinib in mantle cell lymphoma (mcl) or chronic lymphocytic leukemia (cll).</a> J Clin Oncol. 40 (16_suppl), 7520(2022).</li>
<li>Roué, G., Sola, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Management+of+drug+resistance+in+mantle+cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Management of drug resistance in mantle cell lymphoma.</a> Cancers. 12 (6), 1565(2020).</li>
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<li>Bryant, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+intermediate-grade+%28mantle+cell%29+and+low-grade+%28small+lymphocytic+and+marginal+zone%29+human+non-Hodgkin%27s+lymphomas+xenotransplanted+in+severe+combined+immunodeficiency+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Development of intermediate-grade (mantle cell) and low-grade (small lymphocytic and marginal zone) human non-Hodgkin's lymphomas xenotransplanted in severe combined immunodeficiency mouse models.</a> Lab Invest. 80 (4), 557-573 (2000).</li>
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<li>Jubelin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+in+vitro+culture+models+in+oncology+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biosci%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional in vitro culture models in oncology research.</a> Cell Biosci. 12 (1), 155(2022).</li>
<li>Hickman, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+models+of+cancer+for+pharmacology+and+cancer+cell+biology%3A+Capturing+tumor+complexity+in+vitro%2Fex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional models of cancer for pharmacology and cancer cell biology: Capturing tumor complexity in vitro/ex vivo.</a> Biotechnol J. 9 (9), 1115-1128 (2014).</li>
<li>Rossi, M., Alviano, F., Righi, S., Sabattini, E., Agostinelli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+models%3A+A+novel+approach+for+lymphoma+research%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cancer+Res+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional models: A novel approach for lymphoma research.</a> J Cancer Res Clin Oncol. 148 (4), 753-765 (2022).</li>
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<li>Chiron, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+targeted+therapies+to+overcome+microenvironment-dependent+expansion+of+mantle+cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Rational targeted therapies to overcome microenvironment-dependent expansion of mantle cell lymphoma.</a> Blood. 128 (24), 2808-2818 (2016).</li>
<li>Nylund, P., Nikkarinen, A., Ek, S., Glimelius, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Empowering+macrophages%3A+The+cancer+fighters+within+the+tumour+microenvironment+in+mantle+cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Empowering macrophages: The cancer fighters within the tumour microenvironment in mantle cell lymphoma.</a> Front Immunol. 15, 1373269(2024).</li>
<li>Nygren, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+levels+are+prognostic+in+mantle+cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">T-cell levels are prognostic in mantle cell lymphoma.</a> Clin Cancer Res. 20 (23), 6096-6104 (2014).</li>
<li>Medina, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stromal+cells+protect+mantle+cell+lymphoma+cells+from+spontaneous+and+drug-induced+apoptosis+through+secretion+of+b-cell+activating+factor+and+activation+of+the+canonical+and+non-canonical+nuclear+factor+%CE%BAb+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stromal cells protect mantle cell lymphoma cells from spontaneous and drug-induced apoptosis through secretion of b-cell activating factor and activation of the canonical and non-canonical nuclear factor κb pathways.</a> Haematologica. 97 (8), 1255-1263 (2012).</li>
<li>Jindal, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+cers6-as1%2Ffgfr1+axis+as+synthetic+vulnerability+to+constrain+stromal+cells+supported+proliferation+in+mantle+cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Targeting cers6-as1/fgfr1 axis as synthetic vulnerability to constrain stromal cells supported proliferation in mantle cell lymphoma.</a> Leukemia. 38 (10), 2196-2209 (2024).</li>
<li>Nie, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+patient-derived+organoid+culture+platform+for+mantle+cell+lymphoma+drug+sensitivity+and+car+t+cell+anti-tumor+activity+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Establishment of a patient-derived organoid culture platform for mantle cell lymphoma drug sensitivity and car t cell anti-tumor activity assay.</a> Blood. 140 (Supplement 1), 9219-9220 (2022).</li>
<li>Hinton, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+printing+of+complex+biological+structures+by+freeform+reversible+embedding+of+suspended+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels.</a> Sci Adv. 1 (9), e1500758(2015).</li>
<li>Van Der Kuip, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-term+culture+of+breast+cancer+tissues+to+study+the+activity+of+the+anticancer+drug+Taxol+in+an+intact+tumor+environment%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Short-term culture of breast cancer tissues to study the activity of the anticancer drug Taxol in an intact tumor environment.</a> BMC Cancer. 6 (1), 86(2006).</li>
<li>Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+mitochondrial+membrane+potential+using+fluorescent+rhodamine+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives.</a> Biophys J. 76 (1), 469-477 (1999).</li>
<li>Porter, A. G., Jänicke, R. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+roles+of+caspase-3+in+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differentiat%22%5BJournal%5D)">Emerging roles of caspase-3 in apoptosis.</a> Cell Death Differentiat. 6 (2), 99-104 (1999).</li>
<li>Huseynov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+mantle+cell+lymphoma+in+transplant+non-eligible+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Hematol+Transfus+Cell+Ther%22%5BJournal%5D)">Treatment of mantle cell lymphoma in transplant non-eligible patients.</a> Hematol Transfus Cell Ther. 44, S2-S3 (2022).</li>
<li>Augustine, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3d+bioprinted+cancer+models%3A+Revolutionizing+personalized+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Oncol%22%5BJournal%5D)">3d bioprinted cancer models: Revolutionizing personalized cancer therapy.</a> Transl Oncol. 14 (4), 101015(2021).</li>
<li>Budharaju, H., Sundaramurthi, D., Sethuraman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embedded+3d+bioprinting+%E2%80%93+an+emerging+strategy+to+fabricate+biomimetic+%26+large+vascularized+tissue+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Bioact+Mater%22%5BJournal%5D)">Embedded 3d bioprinting – an emerging strategy to fabricate biomimetic & large vascularized tissue constructs.</a> Bioact Mater. 32, 356-384 (2024).</li>
<li>Seaman, K., Sun, Y., You, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+cancer-on-a-chip+tissue+models+to+dissect+the+tumour+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Med-X%22%5BJournal%5D)">Recent advances in cancer-on-a-chip tissue models to dissect the tumour microenvironment.</a> Med-X. 1 (1), 11(2023).</li>
<li>Davies, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+complex+tumour+biology+in+vitro%3A+Histological+and+molecular+characterisation+of+precision+cut+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Capturing complex tumour biology in vitro: Histological and molecular characterisation of precision cut slices.</a> Sci Rep. 5 (1), 17187(2015).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Millipore+PICM03050%3A+Millicell+Standing+Cell+Culture+Inserts+Data+Sheet%22">Millipore PICM03050: Millicell Standing Cell Culture Inserts Data Sheet</a>. , Merck KGaA. Darmstadt, Germany. (2025).</li>
<li>Lamaison, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+3d+culture+model+recapitulates+primary+fl+b-cell+features+and+promotes+their+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Adv%22%5BJournal%5D)">A novel 3d culture model recapitulates primary fl b-cell features and promotes their survival.</a> Blood Adv. 5 (23), 5372-5386 (2021).</li>
<li>Kramer, R. H., Rosen, S. D., McDonald, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basement-membrane+components+associated+with+the+extracellular+matrix+of+the+lymph+node%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Basement-membrane components associated with the extracellular matrix of the lymph node.</a> Cell Tissue Res. 252 (2), 367-375 (1988).</li>
<li>Kaldjian, E. P., Gretz, J. E., Anderson, A. O., Shi, Y., Shaw, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+molecular+organization+of+lymph+node+T+cell+cortex%3A+A+labyrinthine+cavity+bounded+by+an+epithelium-like+monolayer+of+fibroblastic+reticular+cells+anchored+to+basement+membrane-like+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunol%22%5BJournal%5D)">Spatial and molecular organization of lymph node T cell cortex: A labyrinthine cavity bounded by an epithelium-like monolayer of fibroblastic reticular cells anchored to basement membrane-like extracellular matrix.</a> Int Immunol. 13 (10), 1243-1253 (2001).</li>
<li>German, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plug-and-play+lymph+node-on-chip%3A+Secondary+tumor+modeling+by+the+combination+of+cell+spheroid%2C+collagen+sponge%2C+and+T-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Plug-and-play lymph node-on-chip: Secondary tumor modeling by the combination of cell spheroid, collagen sponge, and T-cells.</a> Int J Mol Sci. 24 (4), 3183(2023).</li>
<li>Benton, G., Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Koblinski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrigel%3A+From+discovery+and+ecm+mimicry+to+assays+and+models+for+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliver+Rev%22%5BJournal%5D)">Matrigel: From discovery and ecm mimicry to assays and models for cancer research.</a> Adv Drug Deliver Rev. 79-80, 3-18 (2014).</li>
<li>Ogassavara, B., Tucunduva Neto, R. R., De Souza, R. R., Tucunduva, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasound+evaluation+of+the+morphometric+patterns+of+lymph+nodes+of+the+head+and+neck+in+young+and+middle-aged+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Radiol+Brasileira%22%5BJournal%5D)">Ultrasound evaluation of the morphometric patterns of lymph nodes of the head and neck in young and middle-aged individuals.</a> Radiol Brasileira. 49 (4), 225-228 (2016).</li>
<li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+and+its+therapeutic+potential+for+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduct+Target+Ther%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix and its therapeutic potential for cancer treatment.</a> Signal Transduct Target Ther. 6 (1), 1-24 (2021).</li>
<li>Subrahmanyam, N., Ghandehari, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+extracellular+matrix+biology+for+tumor+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Personalized+Med%22%5BJournal%5D)">Harnessing extracellular matrix biology for tumor drug delivery.</a> J Personalized Med. 11 (2), 88(2021).</li>
<li>Ahmad, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+of+extracellular+matrix+and+drug+correlations+in+disease+management%5BTitle%5D)+AND+%22Asian+J+Pharma+Sci%22%5BJournal%5D)">Prospective of extracellular matrix and drug correlations in disease management.</a> Asian J Pharma Sci. 16 (2), 147-160 (2021).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>&-slide 8ウェルガラス底</td><td>イビディGmbH</td><td>80827</td><td>ハイドロゲルスライスのライブイメージングに使用されるガラス底スライド</td></tr><tr><td>10 倍の PBS</td><td>カール・ロスGmbH + Co.KG</td><td>9150.1</td><td>バイオインク成分</td></tr><tr><td>10X RPMI-1640 ミディアム</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>R1145</td><td>バイオインク成分</td></tr><tr><td>2.5ml気密シリンジモデル1002 TLL</td><td>ハミルトン</td><td>81420</td><td>バイオプリンティング用シリンジ</td></tr><tr><td>3D押出プリンタ、PrintrBot Simple</td><td>プリントロボット</td><td></td><td>バイオインクの印刷を可能にする自己修正</td></tr><tr><td>6ウェルプレート</td><td>Th. Geyer GmbH &Co.KG</td><td>7696790</td><td>ハイドロゲルスライスの培養</td></tr><tr><td>ボトルトップ真空ろ過システム、PESメンブレン、500 ml、0.22 &m細孔径、70&nbsp;mm径メンブレン</td><td>コーニング株式会社</td><td>513-3355</td><td>バッファーの無菌ろ過</td></tr><tr><td>塩化カルシウム脱水物</td><td>カール・ロスGmbH + Co.KG</td><td>T885.2</td><td>洗浄バッファーとゼラチンスラリーの成分</td></tr><tr><td>ラット由来のコラーゲンI</td><td>コーニング株式会社</td><td>CLS354249</td><td>バイオインク成分</td></tr><tr><td>Cura バージョン 15.04.5 3D プリンティング用ソフトウェア</td><td>アルティメーカー</td><td></td><td>3Dプリントに使用するソフトウェア</td></tr><tr><td>ドラキュ5</td><td>バイオステータス株式会社</td><td>DR50050</td><td>ハイドロゲルスライスのライブイメージング用染色</td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸(EDTA)二ナトリウム塩二水和物</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>E5134</td><td>アルギン酸溶解緩衝液の成分</td></tr><tr><td>EVE自動セルカウンター</td><td>ナノエンテック株式会社</td><td>10027-452</td><td>セルカウンター</td></tr><tr><td>Falcon Bacteriological Petri皿 蓋付き、直径35 mm</td><td>隼</td><td>351008</td><td>ゼラチンスラリーを充填し、バイオプリンティング用サポートバスを形成します</td></tr><tr><td>ファルコンチューブ、50mL</td><td>サルシュテットAG&サルシュテットAGCo.KG</td><td>62.547.254</td><td></td></tr><tr><td>子牛胎児血清</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>S0615</td><td>細胞培養培地サプリメント</td></tr><tr><td>ブタの皮からのゼラチン</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>G1890</td><td>ゼラチンスラリーの主成分</td></tr><tr><td>HEPES、遊離酸、分子生物学グレード</td><td>メルクKGaA</td><td>CAS 7365-45-9</td><td>洗浄バッファーとゼラチンスラリーの成分</td></tr><tr><td>Jeko-1 MCL細胞株</td><td>ATCCの</td><td>CRL-3006</td><td>MCL細胞株</td></tr><tr><td>KIMTECH Science Precisionワイプ</td><td>キンバリー・クラーク・コーポレーション</td><td>7551</td><td>ゼラチンスラリーから余分な水分を吸い込み、3Dプリンターのノズルから液滴を除去するために使用されます</td></tr><tr><td>LAS X ソフトウェア バージョン 3.5.7.23225</td><td>ライカ</td><td></td><td>3D再構成に使用するソフトウェア</td></tr><tr><td>ライカ TCS SP8 共焦点レーザー走査型顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>TCS SP8</td><td>ライブイメージング用共焦点顕微鏡</td></tr><tr><td>メイソンジャーレギュラーパイント16オンス</td><td>ボール株式会社</td><td>G001</td><td>ゼラチンスラリーを調製する瓶</td></tr><tr><td>マトリゲル成長因子還元(GFR)基底膜マトリックス</td><td>コーニング株式会社</td><td>356231</td><td>バイオインク成分</td></tr><tr><td>ミリセル細胞培養インサート、0.4 & micro;M 細孔サイズ</td><td>メルクKGaA</td><td>ピクモルグ50</td><td>ハイドロゲルスライスのフィルターサポート</td></tr><tr><td>NucView 405 Caspase-3 基質、1 mM PBS 1 個</td><td>バイオティウム</td><td>10405</td><td>ハイドロゲルスライスのライブイメージング用染色</td></tr><tr><td>Oster プロフェッショナルシリーズブレンダー</td><td>オスター</td><td>BPST02-B00</td><td>ゼラチンスラリーを生成するブレンダー</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプタマイシン</td><td>ギブコ</td><td>15140163</td><td>MCL細胞培地用サプリメント</td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay-Kits und dsDNA-Reagenzien</td><td>インビトロゲン</td><td>P7589</td><td>ハイドロゲルスライスのライブイメージング用染色</td></tr><tr><td>ロティーナ 35 R</td><td>ヘティヒ</td><td>24573</td><td>細胞の遠心分離</td></tr><tr><td>ROTINA 38/38R遠心分離機</td><td>ヘティヒ</td><td>Z720109</td><td>ゼラチンスラリーの遠心分離</td></tr><tr><td>RPMI-1640+グルタマックス</td><td>ギブコ</td><td>61870036</td><td>MCL細胞用培地のベース</td></tr><tr><td>アルギン酸ナトリウム</td><td>FMC協力</td><td>GQ9109901</td><td>バイオインク成分</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>メルクKGaA</td><td>1.06404</td><td>アルギン酸溶解緩衝液の成分</td></tr><tr><td>クエン酸ナトリウム</td><td>カール・ロスGmbH + Co.KG</td><td>3580.1</td><td>アルギン酸溶解緩衝液の成分</td></tr><tr><td>ステリカン鈍的適用カニューレ 21G 0.8x22 mm</td><td>B.ブラウン</td><td>9180109</td><td>3Dプリント用ノズル</td></tr><tr><td>テトラメチルローダミン-メチルエステル-過塩素酸塩(TMRM)</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>T5428</td><td>ハイドロゲルスライスのライブイメージング用染色</td></tr><tr><td>トリパンブルー、0.4%</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>T8154</td><td>生存率分析のための染色</td></tr><tr><td>防水温度計</td><td>VWRの</td><td>620-2099</td><td>ゼラチンスラリーの温度を監視する温度計</td></tr></tbody></table>

マントル細胞リンパ腫の 3d モデルとしてのヒドロゲル腫瘍スライスのバイオプリンティング

Bioprinting of Hydrogel Tumor Slices as a 3D Model for Mantle Cell Lymphoma

MCL細胞を含むヒドロゲル腫瘍スライスは、上記のプロトコルで生成されました。ヒドロゲル腫瘍スライスを3Dプリンティングして培養するためのワークフローのステップを図1Aに示します。使用された3Dプリンターは、Hinton et al.20(図1B)に記載されているように、シリンジポンプエクステンダーを追加することにより、FRESH印刷用に変更されました。最大5つのスライスを一度に印刷し(図1C)、1つのフィルターサポート(図1D)で培養しました。ヒドロゲル腫瘍スライスに栄養素を供給するために、フィルターサポートの下に培地を追加しました。各ヒドロゲル腫瘍スライスの上に培地を一滴加えて、乾燥を防ぎました。1つのフィルターサポートで培養された5つのヒドロゲル腫瘍スライスの概要を、ヒドロゲルスライスのクローズアップ画像とともに図1Eに示します。3日間の培養期間中、ヒドロゲル腫瘍スライスは安定しており、その構造を維持しました(図2A)。印刷直後、ヒドロゲル腫瘍スライスに気泡が存在しましたが、培養中に消えました(図2A)。
懸濁培養(2D)で培養したJeko-1細胞と比較して、ハイドロゲル腫瘍スライス(3D)で培養したMCL細胞株Jeko-1の生存率をトリパンブルー排除アッセイによって評価しました(図2B)。3日間の培養後、細胞の80%が生存していたのに対し、印刷前のJeko-1細胞の初期生存率は88%でした。2Dで培養したJeko-1細胞は、88%の初期生存率を維持しました。2Dと3Dで培養したJeko-1細胞の間に有意差はありませんでした。Jeko-1細胞がヒドロゲルスライスで増殖するかどうかを評価するために、ヒドロゲルスライスあたりのJeko-1細胞の平均細胞数を決定しました(図2C)。5x105 Jeko-1細胞は、印刷直後(d0)に各スライスに含まれていましたが、培養3日後、この数はほぼ2倍の9.3x105 細胞になりました。
ハイドロゲルスライスで培養したJeko-1細胞の分布と状態は、印刷直後または培養3日後に4色のライブ蛍光イメージング(図2D)によって評価されました。印刷後、Jeko-1ハイドロゲルスライスの3D再構成は、細胞の均一な分布を示しました。細胞の大部分は、ミトコンドリア膜電位のマーカーであるTMRMに対して陽性でした22。少数の細胞は、アポトーシス誘導のマーカーであるカスパーゼ-3活性23、および死細胞マーカーPicoGreen21に対して陽性でした。培養3日後、細胞クラスターの形成とともに細胞数の増加が観察されました。ほとんどの細胞はTMRM陽性のままでしたが、Caspase-3活性またはPicoGreenが陽性に染色された細胞はごくわずかでした(図2C)。
ハイドロゲルスライス中のMCL細胞が化学療法に反応するかどうかを分析するために、懸濁培養(2D)またはハイドロゲルスライス(3D)のいずれかで培養されたJeko-1細胞を、MCL患者の標準治療の一部である化学療法薬ドキソルビシンで処理しました24。ヒドロゲルスライスの全体的な構造は、ドキソルビシン処理中も維持されました(図3A)。ヒドロゲルスライスで培養したJeko-1細胞の生存率は、ドキソルビシン処理に応答して用量依存的に低下しました。Jeko-1細胞におけるドキソルビシンのIC50は、2D懸濁培養(IC50=2.0μM; 図3B)。4色のライブ蛍光イメージングでは、ドキソルビシン処理に応答してヒドロゲルスライスで培養されたJeko-1細胞においてTMRMの減少とPicoGreenシグナルの増加が示され、治療による生存率の低下が確認されました。4色のライブ蛍光イメージングから得られた画像を3D再構成し、DRAQ5核シグナルに基づいてセグメント化し、補足ファイル1に記載されているPythonスクリプトを使用して分析しました。例示的なセグメンテーションマスクを補足図1に示します。DRAQ5シグナルから同定された細胞数を使用して、総細胞数を決定しました。TMRM、PicoGreen、およびCaspase-3活性が陽性の細胞数を使用して、それぞれ生存細胞、死細胞、またはアポトーシス細胞の割合を特定しました。9 μMドキソルビシンの有無にかかわらず、ヒドロゲルスライス中で3日間培養したJeko-1細胞の4色生蛍光染色の定量は、トリパンブルー排除アッセイと同等の生存率を示しました(表2)。
確立されたMCL細胞株に加えて、3つの異なるMCL患者の初代MCL細胞を2D懸濁培養または3Dヒドロゲルスライスのいずれかで培養しました(図4、補足図2)。病理学者によって検証されたように、3 つの MCL (患者 1-3) はすべて、Ki67 指数が 20%-50% の古典的/一般的な形態でした。初代MCL細胞には、MCL患者のリンパ節から単離されたすべての細胞型が含まれていたため、MCL細胞だけでなく、他の種類の免疫細胞または間質細胞も含まれていました。一次 MCL ヒドロゲル スライスの生存率は、トリパン ブルー排除アッセイによって評価されました。培養4日後、ヒドロゲルスライス中の初代MCL細胞は、印刷前のベースライン生存率71.0%と比較して、43.6%(3日目に45.7%)の生存率を維持しました(図4A)。これは、懸濁液(2D)で培養された細胞と比較して生存率が向上したことを表しており、4日間の培養後の生存率は19.6%(3日目は28.4%)でした。この生存率は、ほとんどの細胞がTMRM陽性で生存可能である一方、亜集団はカスパーゼ-3活性とPicoGreenが陽性であり、それぞれアポトーシスと細胞死を示した4色のライブ蛍光イメージングによって視覚化されました(図4B)。図4Bの定量データを表2に示します。さらに2人のMCL患者からの初代細胞は、それぞれの2D懸濁培養と比較して、ヒドロゲルスライス(3D)で培養した場合に細胞の生存率が増加したことを示しました(補足図1)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68417/68417fig1.jpg"> 
図1:ヒドロゲル腫瘍スライスの 3Dプリンティングのワークフロー。(A)ヒドロゲル腫瘍スライスにおける細胞の3Dプリンティングと培養のワークフロー。(B)ゼラチンサポートバスでのヒドロゲルスライスの3Dバイオプリンティングに使用されるプリンターセットアップ。(C) 3Dプリンターソフトウェアで設計図を印刷する。一度に最大5つのハイドロゲルスライスを印刷しました。(D)ヒドロゲルスライス培養の概略図。ヒドロゲルスライスを6ウェルプレートのフィルターサポート上で培養しました。水分を維持するために、各ヒドロゲルスライスの上に培地を一滴加えました。1つのフィルターサポートで最大5つのヒドロゲルスライスを培養できます。(E)オーバービュー画像またはクローズアップ画像で示すように、フィルターサポート上で培養された3Dプリントされたヒドロゲルスライス。スケールバーは、示されているように5mm、1mm、または200μmを表します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68417/68417fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68417/68417fig2.jpg"> 
図2:3Dプリントされたヒドロゲルスライス での マントル細胞リンパ腫(MCL)細胞株の培養。(A)印刷後(d0)または培養3日後(d3)にMCL細胞株Jeko-1を含む代表的なヒドロゲルスライスのクローズアップ。スケールバーは1mmを表します。(B)トリパンブルー排除アッセイによって評価された、懸濁液(2D)またはヒドロゲルスライス(3D)で2日間培養されたJeko-1細胞の生存率。3つの独立したバイオプリンティング実験の平均±SDが示されています。(C)印刷直後(d0)または最大3日間の培養後(d1-d3)に各ヒドロゲルスライスに含まれるJeko-1細胞数。3つの独立したバイオプリンティング実験の平均±SDが示されています。統計的に有意な差は観察されませんでした (n.s.、p &gt; 0.05、マンホイットニー検定)。(D) 印刷日 (d0) または培養 3 日後 (d3) の Jeko-1 ヒドロゲル スライスの 3 次元再構成。このモデルは、4色のライブ3D蛍光イメージングのzスタックから生成されました。生細胞は赤(TMRM)、アポトーシス細胞は黄色(Caspase-3酵素活性)、死細胞は緑(PicoGreen)、核は青(DRAQ5)で示されています。スケールバーは50μmを表します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68417/68417fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68417/68417fig3.jpg"> 
図3:ヒドロゲルスライスにおけるマントル細胞リンパ腫(MCL)細胞株の薬物治療。(A)3 μMドキソルビシンで3日間処理したMCL細胞株Jeko-1を含む代表的なヒドロゲルスライスのクローズアップ(d3)。スケールバーは1mmを表します。(B)懸濁液(2D)またはヒドロゲルスライス(3D)で培養したJeko-1細胞を、化学療法剤ドキソルビシンの濃度を上げて2日間処理しました。細胞の生存率は、トリパンブルー排除アッセイによって評価されました。4つの独立したバイオプリンティング実験の平均±SDが示されています。(C)9μMドキソルビシン(Doxo)で3日間処理したJeko-1ヒドロゲルスライスの3次元再構成(d3)。このモデルは、4色のライブ3D蛍光イメージングのzスタックから生成されました。生細胞は赤(TMRM)、アポトーシス細胞は黄色(Caspase-3酵素活性)、死細胞は緑(PicoGreen)、核は青(DRAQ5)で示されています。スケールバーは50μmを表します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68417/68417fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68417/68417fig4.jpg"> 
図4:3Dプリントされたヒドロゲルスライスでの初代MCL細胞の培養。 (A)トリパンブルー排除アッセイによって評価される、懸濁液(2D)またはヒドロゲルスライス(3D)で最大4日間培養された初代MCL細胞の生存率。1つの実験の平均実行率が示されています。(B)ハイドロゲルスライス(3D)で3日間培養した初代MCL細胞の3次元再構成。Zスタックは、4色のライブ染色で染色されたヒドロゲルスライスから生成され、共焦点レーザー走査顕微鏡(CLSM)を使用して分析されました。生細胞は赤(TMRM)、アポトーシス細胞は黄色(Caspase-3酵素活性)、死細胞は緑(PicoGreen)、核は青(DRAQ5)で示されています。スケールバーは50μmを表します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68417/68417fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>汚す</td>
			<td>TMRMの</td>
			<td>ドラキュ5</td>
			<td>NucView405 Caspase-3 基質</td>
			<td>ピコグリーン</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>励起/発光</td>
			<td>548 nm/574 nm</td>
			<td>647 nm/681 nm</td>
			<td>429 nm/469 nm</td>
			<td>488 nm/520 nm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1:4色のライブ3D蛍光イメージングに使用される染色剤の励起/発光の最大値。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td rowspan="2">見本</td>
			<td colspan="3">セルの割合</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMRM(生細胞)</td>
			<td>PicoGreen(死んだ細胞)</td>
			<td>カスパーゼ-3(アポトーシス細胞)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jeko-1 Ctrl</td>
			<td>83</td>
			<td>23.6</td>
			<td>18.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jeko-1 ドキソ 9 μM</td>
			<td>27.6</td>
			<td>81.3</td>
			<td>86.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>原発性 MCL 患者 1</td>
			<td>75.2</td>
			<td>31.1</td>
			<td>33.1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2:培養されたヒドロゲル腫瘍スライスの4色ライブ染色の3D再構成の定量化。 ヒドロゲル腫瘍スライスを 3 日間培養し、9 μM ドキソルビシンまたは初代 MCL 細胞による処理の有無にかかわらず培養した Jeko-1 細胞のいずれかを含みました (患者 1)。
補足図1: 4色ライブ染色の3D再構成からの細胞同定。 (A)4色のライブ染色と(B)Pythonイメージング解析パイプラインを使用して生成されたこのチャネル上のセグメント化された画像から得られたDRAQ5で標識された共焦点画像の3D再構成。スケールバーは200μmを表します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68417/JoVE_Suppl_Figure%201.tiff" target="_blank">この図をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足 Figure 2: ヒドロゲル腫瘍スライスにおける患者 2 および 3 の初代 MCL 細胞の培養 。 (A) 患者 2 または (B) 患者 3 の初代 MCL 細胞の生存率を懸濁液 (2D) またはヒドロゲル スライス (3D) で最大 4 日間培養した トリパンブルー排除アッセイによって評価される。1つの実験の平均実行率が示されています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68417/JoVE_Suppl_Figure%202.tiff" target="_blank">この図をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足ファイル1: 4色ライブ染色から得られた3D再構成の分析手順。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68417/Supplementary_File_1_proof%20read%20version.docx" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足ファイル2:4色のライブ染色から得られた3D再構成を解析するためのPythonスクリプト。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68417/Supplementary_File_2.ipynb%20" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足コーディング File 1: Stl. ヒドロゲル腫瘍スライスの設計図を含むファイル。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68417/Hydrogel%20slice%208mm%201.5mm.stl" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

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